En campos como la investigación patológica, los estudios del microambiente tumoral y el cribado de biomarcadores, la inmunofluorescencia múltiple (mIHC) ha surgido como la tecnología central para la detección precisa in situ de proteínas.

La inmunohistoquímica tradicional o la IF de un solo marcador suele aparecer como más económica en términos de costo intuitivo, por lo que es fácilmente preferida en las etapas iniciales del diseño experimental. Sin embargo, si desmontamos desde el punto de vista estructural del sistema experimental, nos daremos cuenta de que contiene inherentemente un problema largamente ignorado: debe depender de múltiples secciones teñidas por separado para obtener información de múltiples indicadores. Este camino de diseño significa que la misma región tisular debe ser cortada en múltiples secciones seriadas y cada sección debe completar la recuperación antigénica, el bloqueo, la incubación con anticuerpos y la visualización como un sistema experimental independiente. La integración final de los datos solo puede depender de la "inferencia de ensamblaje de imágenes" entre diferentes secciones.

The familia Bcl-2 está compuesta por varias proteínas conservadas evolutivamente que contienen dominios de homología a Bcl-2 (BH) y regulan la apoptosis mediante el control de la permeabilidad de la membrana mitocondrial y la liberación del citocromo c. Se han identificado cuatro dominios BH (BH1-BH4) que median interacciones proteicas. La familia puede separarse en tres grupos basándose en su función y homología de secuencia: los miembros pro-supervivencia incluyen Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, A1 y Bcl-w; las proteínas pro-apoptóticas incluyen Bax, Bak y Bok; y las proteínas "BH3 only" son Bad, Bik, Bid, Puma, Bim, Bmf, Noxa y Hrk. Las interacciones entre los miembros de la familia Bcl-2 promotores de muerte y supresores de muerte han llevado al desarrollo de un modelo de reóstato en el que la relación entre proteínas pro-apoptóticas y anti-apoptóticas controla el destino celular. Por lo tanto, los miembros pro-supervivencia ejercen su comportamiento mediante la unión a los miembros promotores de muerte y su antagonismo. En general, los "miembros BH3-only" pueden unirse y antagonizar las proteínas pro-supervivencia, provocando un aumento de la apoptosis. Si bien existe probablemente cierta redundancia en este sistema, la especificidad tisular y la regulación transcripcional y post-traduccional de muchos de estos miembros de la familia pueden explicar roles fisiológicos distintos.

La apoptosis es un proceso fisiológico regulado que conduce a la muerte celular. Las caspasas, una familia de proteasas cisteínicas ácidas, son reguladores centrales de la apoptosis. Las caspasas iniciadoras (incluidos los números 2, 8, 9, 10 y 12) están estrechamente acopladas a las señales proapoptóticas, que incluyen FasL, TNF-α y daño en el ADN. Una vez activadas, estas caspasas clivan y activan las caspasas efectoras aguas abajo (incluidos los números 3, 6 y 7), las cuales a su vez clivan proteínas citoesqueléticas y nucleares como PARP, α-fodrina, DFF y lamina A, e inducen la apoptosis.

Anticuerpo de la familia Bcl-2 pro-apoptótica

La familia Bcl-2 se compone de varias proteínas conservadas evolutivamente que contienen dominios de homología de Bcl-2 (BH) y regulan la apoptosis mediante el control de la permeabilidad de la membrana mitocondrial y la liberación del citocromo c. Se han identificado cuatro dominios BH (BH1-BH4) que median las interacciones proteicas. La familia puede dividirse en tres grupos según su función y homología de secuencia: los miembros pro-supervivencia incluyen Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, A1 y Bcl-w; las proteínas pro-apoptóticas incluyen Bax, Bak y Bok; y las proteínas "BH3 only" Bad, Bik, Bid, Puma, Bim, Bmf, Noxa y Hrk. Las interacciones entre los miembros de la familia Bcl-2 que promueven la muerte y aquellos que suprimen la muerte han llevado a un modelo de reóstato en el que la proporción de proteínas pro-apoptóticas y anti-apoptóticas controla el destino celular (4). Por lo tanto, los miembros pro-supervivencia ejercen su comportamiento uniéndose y antagonizando a los miembros promotores de la muerte. En general, los "miembros BH3-only" pueden unirse y antagonizar las proteínas pro-supervivientes llevando al aumento de la apoptosis. Aunque probablemente exista cierta redundancia en este sistema, la especificidad tisular, la regulación transcripcional y post-traduccional de muchos de estos miembros familiares puede explicar roles fisiológicos distintos.

La sinapsis es la unidad de transferencia de información en el cerebro entre neuronas. La transferencia sináptica se inicia por la fusión de vesículas sinápticas impulsada por potenciales de acción en el terminal presináptico para liberar neurotransmisores. El complejo molecular básico que impulsa todos los eventos de fusión de membrana en todas las células incluye proteínas receptoras del factor sensible a N-etilmaleímida (SNARE) que forman un complejo trans-ternario entre las membranas por fusionarse. La "acercamiento" o entrelazado de las proteínas SNARE proporciona la energía necesaria para la fusión de membranas. En la sinapsis, las proteínas SNARE incluyen la proteína asociada a sinaptosomas de 25 kDa (SNAP25), la sintaxina 1A (STX1A) y la proteína asociada a vesícula membranosa 2 (VAMP2, también denominada sinaptobreína). La liberación de neurotransmisores, sin embargo, es un proceso altamente regulado que ocurre en respuesta al influxo de Ca2+ impulsado por el potencial de acción. La regulación de la fusión de vesículas sinápticas está mediada por proteínas asociadas a SNARE, como la complejina y la proteína sináptica asociada a Ca2+, la sinaptotagmina-1, que funcionan cooperativamente para iniciar la fusión de vesículas sinápticas inducida por Ca2+. El ciclo de la vesícula sináptica representa un ciclo de eventos que preparan la vesícula sináptica antes de la fusión y recuperan la membrana fusionada tras la fusión completa. Las proteínas asociadas a vesículas sinápticas, como la sinapsina-1 y la sinapsifisina, así como las proteínas de la membrana diana, como Munc18-1, desempeñan un papel complejo en el primado de las vesículas sinápticas para hacerlas competentes para fusionarse.

La clave de la lisado celular radica en equilibrar la violencia y la suavidad, garantizar la integridad proteica y proporcionar una base fiable para el análisis posterior.

AMPK es un complejo heterotrimérico compuesto por una subunidad catalítica α y subunidades regulatorias β y γ, cada una de las cuales está codificada por dos o tres genes distintos (α1, 2; β1, 2; γ1, 2, 3). La quinasa se activa por un aumento en la relación AMP/ATP debido al estrés celular y ambiental, como el choque térmico, la hipoxia y la isquemia. El supresor tumoral LKB1 fosforila a AMPKα en Thr172 dentro del bucle de activación, y esta fosforilación es necesaria para la activación de AMPK. Las evidencias acumuladas indican que AMPK no solo regula el metabolismo de los ácidos grasos y el glucógeno, sino que también modula la síntesis de proteínas y el crecimiento celular a través de las vías EF2 y TSC2/mTOR, así como el flujo sanguíneo mediante eNOS/nNOS.

Los proteínas del grupo poliglobina (PcG) contribuyen al mantenimiento de la identidad celular, a la autorrenovación de células madre y a la regulación del ciclo celular, así como a la oncogénesis, mediante el mantenimiento del estado silenciado de los genes que promueven la especificación de linajes celulares, la muerte celular y la detención del ciclo celular. Los proteínas PcG existen en dos complejos que cooperan para mantener el silenciamiento génico a largo plazo mediante modificaciones epigenéticas del cromatina. El primer complejo, Eed-Ezh2, es reclutado a los genes por factores de transcripción unidos al ADN y metila la histona H3 en Lisina 27. Esta actividad de histona metiltransferasa requiere las subunidades Ezh2, Eed y Suz12 del complejo. La metilación de Lisina 27 facilita el reclutamiento del segundo complejo, PRC1, que ubiquitina la histona H2A en Lisina 119. El PRC1 está compuesto por Bmi1 y RING1A (también RING1 o RNF1), los cuales actúan para potenciar la actividad de ligasa E3 de ubiquitina de una subunidad catalítica adicional, RING1B (también RING2 o RNF2). Los proteínas PcG juegan un papel importante en la regulación de la proliferación celular y el envejecimiento mediante la represión de los genes p16 INK4A y p19 ARF, y son necesarios para el mantenimiento de las células madre hematopoyéticas y neurales adultas, así como de las células madre embrionarias.

La fosfolipasa C específica de fosfoinositídeos (PLC) desempeña un papel fundamental en la señalización transmembrana. En respuesta a estímulos extracelulares, como hormonas, factores de crecimiento y neurotransmisores, el PLC hidroliza el fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) para generar dos mensajeros secundarios: inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) y diacilgliceroles (DAG). Se han identificado al menos cuatro familias de PLCs: PLCβ, PLCγ, PLCδ y PLCε. La fosforilación es uno de los mecanismos clave que regulan la actividad del PLC. El PLCγ se activa tanto por quinasas tirosina receptoras como no receptoras. El PLCγ forma un complejo con receptores de EGF y PDGF, lo cual conduce a la fosforilación del PLCγ en Tyr771, 783 y 1248. La fosforilación por Syk en Tyr783 activa la actividad enzimática del PLCγ1. El PLCγ2 está implicado en la señalización dependiente de antígeno en células B y en la señalización dependiente de colágeno en plaquetas. La fosforilación por Btk o Lck en Tyr753, 759, 1197 y 1217 se correlaciona con la actividad del PLCγ2.