ELISA

La matriz se refiere a todos los componentes de una muestra excepto el analito objetivo, como proteínas, lípidos, sales, pigmentos y sustancias orgánicas de pequeña molécula en la matriz de la muestra. El efecto de matriz es un fenómeno en el que estos componentes de la matriz interactúan con el analito objetivo o el sistema analítico, interfiriendo en la separación, extracción del analito objetivo o la respuesta de detección, y finalmente haciendo que los resultados analíticos se desvíen de los valores verdaderos. Este tipo de interferencia está ampliamente presente en muestras biológicas como suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, homogenizados de tejidos y medios de cultivo celular, y es una causa común de mala repetibilidad y cuantificación inexacta en experimentos ELISA.

ELISA es uno de los experimentos fundamentales en inmunología, y la mayoría de los investigadores del campo de las ciencias de la vida están familiarizados con él. Debido a sus características de alta especificidad, alta sensibilidad y cuantificación precisa, la tecnología ELISA se aplica ampliamente tanto en la investigación científica básica como en el diagnóstico clínico. Se cree que muchos de nuestros seguidores que nos siguen también han realizado experimentos ELISA. Hemos compilado una lista de problemas comunes que pueden surgir durante los experimentos ELISA para su referencia.

El portador de fase sólida más utilizado en el ELISA es la placa de microtitulación hecha de poliestireno. Su adsorción de proteínas forma la base de todo el sistema de detección, y el principio fundamental detrás de esto radica en las interacciones no covalentes entre la superficie del material de fase sólida y las moléculas de proteína.

El recubrimiento es el proceso de inmovilizar anticuerpos o antígenos específicos en la superficie de un portador de fase sólida. Su calidad afecta directamente la sensibilidad, especificidad y reproducibilidad del experimento. Es equivalente a construir una "plataforma de reacción exclusiva" para las reacciones antígeno-anticuerpo posteriores.

Existen diferentes opiniones sobre la detección y clasificación del ELISA, y diferentes publicaciones tienen diferentes opiniones de clasificación en términos de principio u operación. Aquí dividimos el ELISA en las siguientes cuatro categorías, y luego explicamos cada categoría en detalle: (1) ELISA directo; (2) ELISA indirecto; (3) ELISA de sándwich; (4) ELISA de inhibición por competencia. Otros ELISA están afiliados a, o derivados de, una combinación de estos cuatro tipos de ELISA.

La tecnología de anticuerpos marcados con enzimas es una técnica de marcaje que implica la conjugación covalente de moléculas enzimáticas a anticuerpos específicos. Su principio fundamental es: utilizar la alta especificidad del anticuerpo para el reconocimiento del antígeno como un "sistema de dirección" para localizar con precisión la molécula objetivo; luego, aprovechar el "efecto de amplificación" catalítico altamente eficiente de la enzima sobre su sustrato para convertir una reacción inmunológica invisible en una señal visible o detectable por instrumentos (como un cambio de color, luminiscencia, etc.). Esto permite el análisis cualitativo, de localización o cuantitativo del antígeno o anticuerpo objetivo.

Fondo alto Sin señal Demasiada señal: placa entera se volvió uniformemente azul Curva estándar lograda pero poca discriminación entre puntos Duplicados deficientes Baja reproducibilidad entre ensayos No hay señal cuando se espera una señal, pero la curva estándar se ve bien Las muestras dan lecturas demasiado altas, pero la curva estándar se ve bien Lecturas muy bajas en toda la placa Se desarrolla color verde al agregar la solución de parada al usar estreptavidina-HRP Efectos de borde

Según el propósito de detección, los tipos comunes de ELISA incluyen el método indirecto (para medir anticuerpos), el método de sandwich de doble anticuerpo (para medir antígenos) y los métodos competitivos. Entre ellos, el método de sandwich de doble anticuerpo y el método indirecto son los más utilizados. El siguiente ejemplo detallará los procedimientos operativos estándar y las consideraciones clave para el método de sandwich de doble anticuerpo.

Las condiciones de recolección y almacenamiento de muestras ELISA enumeradas a continuación tienen la intención de servir como pautas generales. Los protocolos específicos pueden variar según la línea celular o el tipo de tejido. Si se almacena la muestra por un período prolongado, se recomienda probar la estabilidad de la muestra. Evite ciclos repetidos de congelación y descongelación para todos los tipos de muestras.

Estas tres técnicas (RIA, ELISA, Western blot) son técnicas de inmunoensayo fundamentales en biomedicina, utilizadas para detectar biomoléculas específicas (como proteínas, hormonas, anticuerpos). Sus diferencias principales radican en su principio de detección, molécula objetivo, sensibilidad, especificidad, rendimiento y aplicación.