Compartir Literatura: Inmunofluorescencia Múltiple para la Investigación del Microambiente Tumoral de MCC

Compartiendo Literatura: Inmunofluorescencia Multiplex para la Investigación del MCC Microambiente Tumoral

Antecedentes

Carcinoma de célula Merkel (MCC) es un carcinoma neuroendocrino cutáneo agresivo que afecta principalmente a adultos mayores. La incidencia es mayor y ocurre más temprano en individuos inmunocomprometidos, con una alta tasa de recurrencia, metástasis y mortalidad, lo que requiere una evaluación pronóstica efectiva y enfoques de tratamiento. MCC se desarrolla a través de dos vías distintas: la mayoría de los tumores están impulsados por la integración clonal del poliomavirus Merkel célula (MCPyV) y la expresión de antígenos virales oncogénicos T ; los tumores negativos para MCPyV surgen debido a una alta carga de mutaciones tumorales inducida por radiación ultravioleta. Los predictores tradicionales de la respuesta a la inmunoterapia (como la expresión de PD-L1 y la carga de mutaciones tumorales) son ineficaces para MCC, mientras que un análisis detallado del microambiente tumoral (TME) puede predecir más efectivamente la respuesta al tratamiento. Una comprensión profunda del MCC-asociado TME puede proporcionar nuevas estrategias de tratamiento alternativas para pacientes que son ineficaces o intolerantes a la inmunoterapia.

La trasplantación de células tumorales derivadas de ratones en ratones con el mismo fondo genético permite observar con precisión los efectos de los inmunomoduladores sobre los tumores, convirtiéndolo en una herramienta importante para la investigación de la inmunidad anti-tumoral. Por lo tanto, el estudio "Desarrollo de un Ensayo de Inmunofluorescencia Multiplex para Estudios del Microambiente Tumoral de Carcinoma de Célula Merkel Humano y Murino" por Sun L et al. utilizó tecnología de inmunofluorescencia multiplex (mIF) para visualizar simultáneamente múltiples marcadores en una sola sección tisular, desarrollando un método de detección mIF estandarizado adecuado para estudiar el TME de tumores MCC humanos y de ratón.

Métodos de Investigación

Primero, se recolectaron tejidos humanos de MCC excedentes aprobados éticamente y muestras de ratón MCC siguiendo las directrices experimentales animales, todos procesados en secciones fijadas con formalina e incrustadas en parafina (FFPE). Luego, utilizando el factor de transcripción clave MCC SOX2 como marcador tumoral central, los experimentos mIF se diseñaron con células T, macrófagos y marcadores funcionales específicos de especie. Los experimentos mIF se optimizaron mediante condiciones como la concentración de anticuerpos primarios, las condiciones de recuperación del antígeno, el orden de tinción y la selección de fluoróforos. La tinción manual se realizó utilizando el kit Opal 6-Plex, seguido de imagen en la plataforma Mantra/Polaris y análisis con software InForm. Finalmente, la precisión de la identificación de poblaciones celulares se verificó comparando con resultados correspondientes de inmunohistoquímica simple (IHC) y análisis fenotípico, evaluándose la especificidad de las señales fluorescentes y la racionalidad de la distribución espacial.

 Detección de Localización de Anticuerpos Primarios (Tinción con Anticuerpo Monoclonal)

Aunque el tratamiento por microondas puede utilizarse en la detección mIF para liberar anticuerpos primarios y secundarios, evitando reactividad cruzada o residuos de señal, algunos epítopos pueden degradarse e incluso desaparecer después de múltiples tratamientos por microondas, mientras que otros pueden tener señales mejoradas. Por lo tanto, el orden de tinción no puede establecerse arbitrariamente y la posición óptima para cada anticuerpo necesita ser predeterminada. El experimento utilizó secciones positivas que expresan marcadores objetivo, con anticuerpos primarios probados dispuestos en diferentes posiciones de tinción en el grupo experimental y buffer de dilución de anticuerpos primarios añadidos a las posiciones de anticuerpos primarios en el grupo control. Ambos grupos underwent el mismo tratamiento por microondas y reemplazaron los fluoróforos con buffer de dilución de fluoróforos. Luego, la intensidad de fluorescencia en cada posición se evaluó mediante microscopía de fluorescencia. Los datos en la figura muestran claramente el rendimiento de las señales de marcadores en diferentes posiciones de tinción, donde la posición con intensidad de señal celular positiva al menos 5-10 veces el fondo se determinó como la posición de tinción óptima.

La figura muestra el emparejamiento de fluoróforos y los efectos de aplicación de marcadores en muestras tumorales de MCC de ratón. SOX2 se emparejó con el fluoróforo de menor brillo Opal 690 debido a su alta abundancia de expresión; el rendimiento de intensidad de señal y posición de tinción de FOXP3 apoyó el emparejamiento con Opal 780; el marcador de macrófagos F4/80 se emparejó con Opal 480 a pesar de la alta autofluorescencia en el canal correspondiente, ya que su rendimiento de señal fue estable; Arg1 se emparejó con Opal 620 para maximizar la distancia de posición de tinción desde F4/80; CD3 y CD8 se emparejaron con Opal 520 y Opal 570, respectivamente. La figura muestra claramente las imágenes de tinción multiplex e imágenes de canal simple en muestras tumorales de MCC de ratón. Al mismo tiempo, los resultados de tinción multiplex de 4 muestras tumorales adicionales de MCC de ratón fueron similares a estas, y los resultados de tinción multiplex fueron consistentes con los resultados de inmunohistoquímica simple (IHC) de cada marcador, detectando con precisión el análisis fenotípico las poblaciones celulares esperadas.

 Inmunofluorescencia Multiplex de RatónSelección de Marcadores y Verificación de Tinción

La figura muestra el emparejamiento de fluoróforos y los efectos de aplicación de marcadores en muestras tumorales humanas MCC. A diferencia de las muestras de ratón, CD3 y SOX2 como antígenos de alta abundancia se emparejaron con fluoróforos débiles Opal 780 y Opal 690, respectivamente; FOXP3 con expresión débil se emparejó con el fluoróforo brillante Opal 520; el marcador de macrófagos CD163 se predijo que estaría expresado de manera estable, por lo que se emparejó con Opal 480 para tolerar la interferencia de autofluorescencia en los tejidos; PD-L1 se emparejó con Opal 620, y CD8 se emparejó con Opal 570, para lograr separación de posición de tinción desde CD163 y CD3, respectivamente. Aunque CD3 se ubicó después de CD8 en la secuencia final, lo que teóricamente tenía riesgo potencial de estorbo espacial, el análisis fenotípico mostró que la gran mayoría de las células CD8+ co-expresaron CD3+ sin errores de clasificación. La figura muestra claramente las imágenes de tinción multiplex e imágenes de canal simple en muestras tumorales humanas MCC, y los resultados de tinción aplicados a 3 muestras adicionales fueron similares a estos.

Análisis de Resultados Usando Inform

El proceso de análisis se divide en cuatro pasos: el primer paso es visualizar cada canal de tinción individualmente, en combinaciones específicas y como un todo; el segundo paso es la segmentación celular, definiendo regiones en la imagen que representan células individuales; el tercer paso es la clasificación fenotípica, interpretando patrones de expresión de marcadores a través de algoritmos entrenados por el usuario para asignar fenotipos a cada célula, con puntos coloreados representando células de diferentes fenotipos; el cuarto paso es el análisis cuantitativo, contando el número de cada población celular. Los resultados muestran que a pesar del etiquetado de fondo débil en las células tumorales en el canal Opal 780, las células tumorales SOX2+ aún pueden clasificarse correctamente a través del análisis fenotípico digital anterior, distinguiendo efectivamente las señales de expresión CD3 verdaderas en células T de señales falsas no específicas en células tumorales. El orden de tinción de CD3 y CD8 tanto en tejidos tumorales humanos como murinos es cercano, teóricamente con riesgo potencial de estorbo espacial, pero la detección posterior de co-expresión de marcadores multiplex CD3+/CD8+ completada en R software no detectó significativamente células CD3-/CD8+, indicando sin resultados de detección falsa debido al estorbo espacial, asegurando precisión de detección. Además, las secciones mIF de ambos tejidos tumorales son adecuadas para este método de análisis.

Conclusiones

Este estudio aborda los puntos de dolor clínicos y de investigación de predicción insuficiente de respuesta a inmunoterapia en carcinoma de célula Merkel y falta de herramientas adecuadas de detección del TME, centrándose en la tecnología de inmunofluorescencia multiplex, desarrollando y optimizando exitosamente procedimientos de detección mIF estandarizados adecuados para MCC humano y murino. El estudio toma el marcador tumoral MCC altamente específico SOX2 como núcleo, optimizando sistemáticamente vínculos clave tales como concentración de anticuerpos, condiciones de recuperación del antígeno, orden de tinción y emparejamiento de fluoróforos. La verificación a través de una serie de figuras de resultados muestra que tanto los sistemas de tinción MCC humana como murina pueden visualizar con precisión las poblaciones celulares objetivo, con alta precisión de análisis fenotípico, distinguiendo efectivamente señales verdaderas de fondos no específicos, sin estorbo espacial obvio y buena repetibilidad.

Referencias

Sun L, Verhaegen ME, McGue J, Olivei AC, Dlugosz AA, Frankel TL, Harms PW. Development of a Multiplex Immunofluorescence Assay for Tumor Microenvironment Studies of Human and Murine Merkel Cell Carcinoma. Lab Invest. 2024 Oct;104(10):102128. doi: 10.1016/j.labinv.2024.102128. Epub 2024 Aug 23. PMID: 39182611; PMCID: PMC11502254.   

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