Common Antibody Purification Methods
La purificación de anticuerpos se refiere al proceso de aislar anticuerpos policlonales del suero, o anticuerpos monoclonales del fluido de ascitis o del supernatante de líneas celulares de hibridoma. Su objetivo principal es obtener anticuerpos con alta pureza, alta actividad y que cumplan los requisitos de aplicaciones específicas.
La purificación de anticuerpos es un proceso que se basa en las características biológicas de los anticuerpos —como la carga, el tamaño e hidrofobicidad de las moléculas de anticuerpo— para seleccionar métodos apropiados y aislar los anticuerpos objetivo de mezclas complejas mediante técnicas cromatográficas de múltiples pasos.
Generalmente, los métodos de purificación de anticuerpos incluyen cromatografía de afinidad Protein A/G, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración por gel, cromatografía de interacción hidrofóbica y otros, que garantizan la adquisición final de productos de anticuerpos de alta pureza. Un solo paso rápido de captura utilizando cromatografía de afinidad es suficiente para lograr la pureza y cantidad requeridas del producto objetivo. Sin embargo, los anticuerpos o sus fragmentos pueden purificarse adicionalmente para un uso posterior eliminando más impurezas en exceso mediante otros métodos.
La selección de un método de purificación específico depende de factores como la fuente del anticuerpo, las limitaciones de tiempo, consideraciones de costos y la aplicación final del anticuerpo.
Método de precipitación con ácido caprílico-sulfato de amonio
El método de precipitación con ácido caprílico-sulfato de amonio aprovechando las propiedades del ácido caprílico y el sulfato de amonio, precipita y purifica selectivamente los anticuerpos, y se utiliza principalmente para extraer anticuerpos IgG del suero o fluido de ascitis.
En condiciones ligeramente ácidas, el ácido caprílico se une a y precipita otras proteínas en el suero o fluido de ascitis, mientras que los anticuerpos IgG permanecen en el sobrenadante. Esto se debe a que el ácido caprílico altera las capas de hidratación de otras proteínas, causando que precipiten, mientras que los anticuerpos IgG —debido a sus características estructurales— son menos propensos a la precipitación.
Después del tratamiento con ácido caprílico, se utiliza la saturación de sulfato de amonio para precipitación por salting out. El sulfato de amonio compite con los anticuerpos por las moléculas de agua en la solución, reduciendo la solubilidad de los anticuerpos y causando así su precipitación. Se añade lentamente un volumen igual de solución saturada de sulfato de amonio a la muestra de anticuerpo neutralizada, seguido de incubación a temperatura ambiente o 4°C durante varias horas. Después de centrifugación y eliminación del sobrenadante, el precipitado de anticuerpos se disuelve en una solución tampón.
La selectividad, rendimiento, pureza y reproducibilidad de la precipitación dependen de varios factores, incluyendo tiempo, temperatura, pH y la velocidad de adición de sal. La precipitación con sulfato de amonio puede proporcionar una eficacia de purificación suficiente para ciertas aplicaciones de anticuerpos; sin embargo, en la mayoría de los casos, sirve como un paso preliminar de purificación antes que la cromatografía de columna u otros métodos de purificación.
Método de Cromatografía de Afinidad
Purificación de Anticuerpos Usando Cromatografía de Afinidad[1]
La cromatografía de afinidad es una tecnología altamente eficiente de separación y purificación basada en el reconocimiento específico de biomoléculas. Este método forma un sistema de separación con capacidad de adsorción selectiva conjugando ligandos específicos (como Protein A/G/L) a matrices de fase sólida como agarosa. Cuando se añade una mezcla compleja, el ligando puede capturar específicamente el anticuerpo objetivo, mientras que las impurezas son eliminadas y el anticuerpo objetivo finalmente obtenido. Esta tecnología es particularmente adecuada para aislar anticuerpos de mezclas con componentes complejos, donde el contenido de impurezas es mucho mayor que el del anticuerpo objetivo.
Protein A puede unirse eficientemente a IgG de varios mamíferos, incluyendo humanos, ratones, conejos, cerdos y perros. Entre ellos, exhibe afinidad extremadamente alta para los subtipos de IgG1, IgG2 e IgG4 humano, pero tiene una unión débil con IgG3.
En comparación con Protein A, Protein G tiene mayor afinidad de unión a IgG de la mayoría de los mamíferos y puede unirse específicamente a un rango más amplio de tipos de anticuerpos —especialmente aquellos que son difíciles para Protein A de unir, como IgG3 humano, IgG1 de ratón e IgG2a de rata. El Protein G recombinante tiene sus sitios de unión con albúmina y sitios de unión a la superficie celular eliminados, lo cual no solo reduce significativamente la unión inespecífica sino que también mejora la pureza del producto. Esta proteína se ha convertido en una herramienta importante para la purificación de anticuerpos, y es particularmente adecuada para purificar anticuerpos monoclonales y policlonales IgG de mamíferos que no se unen bien a Protein A.
Protein L puede unirse específicamente a las cadenas ligeras κ (kappa) mediante sus cinco dominios homólogos N-terminales. Este modo de unión le permite capturar diversas moléculas de anticuerpo que contienen cadenas ligeras κ. La proteína puede unirse eficazmente a múltiples tipos de anticuerpos, como IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, y también puede reconocer derivados de anticuerpos como fragmentos variables de cadena simple (ScFv) y fragmentos de unión antigénica (Fab). Protein L tiene buena capacidad de unión a anticuerpos derivados de humanos, ratones, ratas y conejos, pero no tiene actividad de unión a inmunoglobulinas de cabras y ovejas. Protein L proporciona una solución importante para la purificación de anticuerpos con estructuras especiales.
Resumen de ligandos bioafines Protein-A, -G, -L y -M[2]
| Tipo de Proteína | Se une a | Ventajas | Inconvenientes |
|---|---|---|---|
| Protein-A | •IgG, fragmentos de IgG y subclases (excepto IgG₃), región quilla que conecta Cₕ₂ y Cₕ₃ en la región Fc de IgG (alta afinidad ~ 10 nM) •Proteínas de fusión Fc •IgM e IgE | •Alto caudal •Alta capacidad de unión •Une Fc y fragmentos Fab y F(ab')₂ de IgG | •Algunas uniones inespecíficas de proteínas de células huésped |
| Protein-G | •IgG₁, IgG₂, IgG₃ e IgG₄ •Región quilla que conecta Cₕ₂ y Cₕ₃ en la región Fc de IgG (alta afinidad ~10 nM) •Dominio constante del Fab a través de Cₕ₁ (afinidad baja μΜ) •IgE humano, IgD e IgA | •Perfil de reactividad más amplio a IgG que Protein-A | •No soporta condiciones de elución tan duras como Protein-A |
| Protein-L | •Vₗ de cadenas ligeras kappa (Kₚ ~ 100 mM), une a IgG, IgM, IgA, IgE e IgD (conteniendo cadenas ligeras variables) | •Muy eficaz para unir anticuerpos en fluido de ascitis o supernatante de cultivo celular •Unión muy efectiva de IgM | •No útil para purificar anticuerpos policlonales |
| Protein-M | •Protein M se une a las regiones conservadas (regiones framework) de las Vₗ y Vₖ cadenas ligeras de anticuerpos | •Especificidad amplia de anticuerpos | •No investigado completamente aún |
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Referencias
[1] Cassedy, A., O’Kennedy, R. (2022). Purificación de Anticuerpos Usando Cromatografía de Afinidad. En: Ayyar, B.V., Arora, S. (eds) Cromatografía de Afinidad. Métodos en Biología Molecular, vol 2466. Humana, Nueva York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2176-9_1.
[2] Murphy, C., Devine, T., & O’Kennedy, R. (2016). Avances tecnológicos en purificación de anticuerpos. Journal of Anticuerpo Technology, 6, 17–32. https://doi.org/10.2147/ANTI.S64762.
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