Compartir Literatura: Aplicación de la Inmunofluorescencia Múltiple en el Estudio de las Estructuras Linfoideas Terciarias Tumorales

Compartir Literatura: Aplicación de la Inmunofluorescencia Multiplex en el Estudio de Estructuras Linfoideas Terciarias del Tumores

Antecedentes

Las Estructuras Linfoideas Terciarias (TLSs) son agregados linfoideos ectópicos que pueden desarrollarse dentro o adyacentes a tumores, activando la inmunidad antitumoral. Su estado de madurez está estrechamente relacionado con la eficacia terapéutica inmunológica y la supervivencia de los pacientes, lo que las convierte en marcadores pronósticos muy prometedores. Sin embargo, la investigación sobre TLSs ha estado a largo plazo limitada por cuellos de botella técnicos: Primero, la inmunohistoquímica convencional de un solo marcador no puede distinguir entre TLSs funcionales y agregados inmunes ordinarios, lo que resulta en altas tasas de juicio incorrecto. Segundo, la falta de evaluación simultánea de marcadores multidimensionales dificulta el establecimiento de estándares de clasificación de madurez. Tercero, la incompatibilidad entre los modelos preclínicos de ratón y las técnicas de detección de muestras de pacientes obstaculiza la investigación traslacional.

Opal-TSA tecnología de inmunofluorescencia multiplex (mIF), con su alta sensibilidad y flexibilidad de tinción, se ha convertido en una elección ideal para romper estos cuellos de botella. La literatura "Protocolo para investigar estructuras linfoideas terciarias en secciones de tejido humano y murino fijados utilizando inmunohistoquímica multiplex Opal-TSA" se centra en Opal-TSA tecnología de inmunofluorescencia multiplex, construyendo un protocolo de investigación estandarizado para TLSs en tejidos tumorales humanos y ratones. Como agregados linfoideos ectópicos clave en el microambiente tumoral, la identificación precisa y caracterización funcional de TLSs son cruciales para la investigación de inmunidad tumoral. A través de la aplicación innovadora de mIF tecnología, esta literatura proporciona un camino confiable para resolver cuellos de botella técnicos en TLSs investigación.

Diseño Experimental

Para determinar la madurez de TLSs, los autores seleccionaron anticuerpos CD4, CD8, CD19, CD21, DC-LAMP, PNAd y DAPI para etiquetado de siete colores de TLSs en secciones de tejido humano fijadas con formalina e incrustadas en parafina. En las secciones de tejido de ratón, el anticuerpo DC-LAMP fue eliminado para etiquetado de seis colores de TLSs. Esto cubre la composición celular central de TLSs mientras distingue TLSs de agregados inmunes ordinarios mediante co-localización de marcadores. El emparejamiento de fluoróforos sigue el principio de antígenos de baja abundancia emparejados con fluoróforos de alta luminosidad: marcadores de baja abundancia con niveles de expresión más bajos se emparejan con fluoróforos más brillantes como Opal™620 o Opal™520, mientras que los marcadores de alta abundancia con niveles de expresión más altos se emparejan con fluoróforos relativamente menos brillantes como Opal™690. El orden de tinción se determinó luego a través de pruebas de estrés térmico. Utilizando condiciones optimizadas de anticuerpos primarios, 6 secciones de control positivo consecutivas fueron sometidas a 1-6 rondas de tratamiento de Recuperación de Epítopos Inducida por Calor (HIER) antes de la tinción. Bajo tiempo de exposición fijo, las diferencias en intensidad de tinción de las secciones fueron observadas: los marcadores sensibles a HIER fueron detectados primero, mientras que los marcadores resistentes a HIER fueron detectados más tarde. Un tampón de glicina a pH bajo de 50°C se utilizó para el lavado de anticuerpos para asegurar la eliminación completa del anticuerpo de la ronda anterior sin afectar las señales fluorescentes ya unidas. Después de la tinción, escaneo panorámico e imagen multispectral fueron realizados utilizando el sistema automatizado de imagen patológica cuantitativa Vectra, combinado con Phenochart, inForm y HALO software para desmezcla espectral de imagen, análisis fenotípico celular y estadísticas cuantitativas.

Co-localización de múltiples marcadores

A través de tecnología Opal-TSA de siete marcadores, tinción multiplex fue realizada en secciones representativas de tejido linfático humano FFPE. Tanto la tinción manual como automatizada identificaron y caracterizaron agregados inmunes y TLSs en secciones de tejido FFPE.

Construyendo un Sistema de Clasificación de Madurez para Tejido Tumoral HumanoTLSs

Para construir un sistema de clasificación de madurez de TLSs, el artículo diseñó un diagrama comparativo de la clasificación de TLSs en diferentes regiones del mismo tejido. Cuatro regiones típicas fueron seleccionadas desde secciones de tejido FFPE de cáncer de próstata humano: infiltración de células inmunes (Grado 0), agregación de células inmunes (Grado 1), TLSs inmaduros (Grado 2) y TLSs maduros (Grado 3). Cuantificación intuitiva de estándares de clasificación se logró mediante tinción uniforme de marcadores e imágenes.

Utilizando el sistema propuesto de clasificación TLSs, TLSs Grado 2 y Grado 3 fueron identificadas exitosamente en secciones de tejido FFPE de melanoma mediante tinción manual. Además, la tinción automatizada fue implementada exitosamente en secciones de tejido FFPE de cáncer de próstata humano. Esto demuestra que el sistema propuesto de clasificación TLSs puede identificar y clasificar agregados inmunes, TLSs inmaduros y TLSs maduros en secciones de tejido tumoral FFPE humano.

Validación de Imagen Interespecífica de TLSs Sistema de Clasificación de Madurez

Para verificar la adaptabilidad interespecífica del protocolo, el artículo presenta simultáneamente imágenes mIF de secciones de tejido de cáncer gástrico de ratón utilizando etiquetado de seis colores con Opal-TSA. Los resultados de la imagen muestran identificación y clasificación precisas de madurez de TLSs en secciones de tejido de ratón, incluyendo infiltración de células inmunes, agregación de células inmunes, TLSs inmaduros y TLSs maduros. Similarmente, TLSs Grado 2 y Grado 3 también pueden ser identificadas exitosamente en secciones de tejido de cáncer gástrico de ratón mediante tinción manual.

El valor de las imágenes interespecíficas reside no solo en verificar la universalidad técnica sino también en construir un puente para estudios correlacionales entre "modelos preclínicos de ratón - muestras clínicas de pacientes". Esto permite que los resultados de investigación sobre mecanismos reguladores de TLSs en modelos de ratón predigan preliminarmente sus perspectivas de aplicación en humanos mediante analogía de características de imagen, acelerando el proceso de investigación básica traslacional a la práctica clínica.

Resumen

A través de la aplicación innovadora de imágenes de inmunofluorescencia multiplex, los autores mejoraron mIF tecnología desde un simple método de tinción hasta una herramienta de investigación impulsada por imagen. Construyeron un protocolo experimental basado en Opal-TSA tecnología de inmunohistoquímica multiplex que permite detección y caracterización in situ de TLSs en secciones de tejido humano y ratón. Este protocolo soporta detección simultánea de hasta 6 marcadores de antígenos y proporciona un sistema de clasificación de apoyo para distinguir TLSs inmaduros y maduros TLSs, ofreciendo un flujo técnico completo desde detección hasta interpretación de resultados para TLSs en el análisis del microambiente inmune tumoral y evaluación de eficacia inmunoterapéutica.

Referencias

Quigley LT, Pang L, Tavancheh E, Ernst M, Behren A, Huynh J, Da Gama Duarte J. Protocol for investigating tertiary lymphoid structures in human and murine fixed tissue sections using Opal™-TSA multiplex immunohistochemistry. STAR Protoc. 2023 Mar 17;4(1):101961. doi: 10.1016/j.xpro.2022.101961. Epub 2023 Jan 10. PMID: 36633948; PMCID: PMC9843255.

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