Compartir literatura: Inmunofluorescencia múltiple combinada con hibridación in situ para el análisis de la inmunopatología de tejidos animales

Compartir Literatura: Inmunofluorescencia Multiplex Combinada con Hibridación in situ para el Análisis de la Immunopatología del Tejido Animal

I. Antecedentes de la Investigación

El tejido como red clave que constituye órganos, sistemas de órganos y funciones biológicas coordinadas de los organismos, su análisis in-situ es crucial para entender y regular los resultados biológicos que afectan la salud animal. Sin embargo, en el campo de la medicina veterinaria, la investigación in-situ ha estado limitada durante mucho tiempo por la escasez de inmunorreguladores compatibles con especies——la disponibilidad de inmunorreguladores dirigidos a células específicas, funciones o marcadores patológicos es extremadamente baja, e incluso cuando se encuentran reactivos relevantes, a menudo solo pueden lograr detección simultánea de uno o pocos marcadores, lo que dificulta la formación de una interpretación biológica completa del estado del tejido.

Basado en este cuello de botella central, la investigación "Tinción in situ con anticuerpos que reaccionan cruzadamente en cerdos, ganado vacuno y ciervos de cola blanca facilita la comprensión del estado tisular biológico e immunopatología" desarrolló un esquema de inmunohistoquímica cromogénica multiplex para estudio comparativo de células inmunes en ganglios linfáticos entre especies, y verificó la capacidad de la tinción fluorescente multiplex para detectar señales de co-localización de proteínas en tejidos porcinos. Dada la escasez y dificultad de preparación de anticuerpos reactivos a proteínas en animales, la investigación propuso además diseñar inmunorreguladores dirigidos a objetivos in-situ a través de diseño de nivel ARN y combinarlos con tinción de anticuerpos de especies en combinaciones multiplex para romper las limitaciones de los inmunorreguladores en la detección in-situ. Para confirmar el papel de la combinación de ARN y proteína en elucidar el estado tisular e immunopatología, la investigación logró tinción combinada de marcadores proteicos específicos celulares con virus Seneca A (SVA) ARN en tejido amigdalar porcino.

II. Métodos de Investigación

Las muestras de tejido fueron fijadas con 10% formalina tamponada neutra durante aproximadamente 24 horas, seguidas por deshidratación rutinaria, incrustación en parafina y corte. Se seleccionaron anticuerpos dirigidos a 5 marcadores clave, incluyendo: marcador de macrófago/célula dendrítica IBA-1, marcador de célula T CD3, marcador de célula B Pax5, marcador de células proliferantes Ki-67, marcador celular epitelial citqueratina. Luego se siguió la lógica de tinción inmunohistoquímica simple y verificación de tinción multiplex, verificación de tinción multiplex de inmunofluorescencia, método cromogénico ARN de hibridación in situ, verificación de detección co-detectada de inmunofluorescencia multiplex y ARN de hibridación in situ. Después del procesamiento, incubación y montaje de muestras, los resultados de tinción fluorescente fueron observados usando microscopio confocal Nikon A1R. La detección co-detectada de inmunofluorescencia multiplex y ARN de hibridación in situ utilizó primero tecnología RNAscope para ARN de hibridación in situ, usando la secuencia genética del capsómero proteico 1 como diseño de sonda diana; la detección co-detectada de proteína y ARN se basó en el kit multiplex de fluorescencia mejorado RNAscope integrado con flujo de trabajo de detección co-detectada de inmunofluorescencia, detectando señales de ARN a través de Opal 570, detectando señales proteicas a través de TSA 650 combinado con anticuerpo secundario. La compatibilidad del anticuerpo con tecnología RNAscope fue verificada primero, luego usando tejido amigdalino de cerdos infectados por SVA como muestras para lograr co-detección de ARN SVA y proteínas marcadores celulares.

III. Análisis de Resultados

Detección IHC de Marcadores en Tejidos Animales

El propósito central de esta figura es verificar la reactividad conservada de los anticuerpos seleccionados en tejidos FFPE de tres especies diferentes relacionadas con veterinaria: cerdo, ganado vacuno y ciervo. El experimento usó tejido amigdalar como muestras de detección, mostrando señales de tinción positiva de CD3, Pax5, IBA-1, gtIBA-1, citqueratina y Ki-67 en las tres especies a través de tinción simple IHC. Todos los anticuerpos seleccionados pueden unirse específicamente y desarrollar color en células objetivo de las tres especies.

Multiplex IHC y Detección de Marcadores en Fluorescencia

La Figura A muestra resultados de tinción cromogénica triple IHC, usando muestras de ganglio linfático traqueobronquial de cerdos, ganado vacuno y ciervo de cola blanca para detectar simultáneamente CD3, Pax5 y IBA-1. Los resultados mostraron que las estructuras inmunes de ganglios linfáticos de las tres especies se ajustan a características histológicas esperadas: áreas paracorticales dominadas por células CD3+ T, sinusoides subcapsulares, trabeculares y medulares dominados por macrófagos/DC IBA-1+, y folículos linfoides dominados por células B Pax5+. Este resultado prueba que la tinción cromogénica triple IHC puede ser utilizada efectivamente para análisis comparativo de estructuras inmunes de ganglios linfáticos entre especies.

La Figura B muestra resultados de tinción inmunofluorescencia cuádruple, usando muestras de ganglio linfático mesentérico porcino para detectar simultáneamente IBA-1, CD3, Pax5 y Ki-67, y mostrando imágenes en escala de grises de canales simples de cada marcador. Los resultados no solo verificaron patrones de distribución celular inmune consistentes con la Figura A, sino que también lograron detección clara de señales de co-localización, identificando directamente células IBA-1+ macrófago/DC, células Pax5+ B y células CD3+ T expresando simultáneamente Ki-67, indicando la presencia de células inmunes proliferantes. Además, la mayoría de las células Ki-67+ se co-localizaron con células Pax5+ y se concentraron dentro de folículos linfoides, probando la existencia de centros germinales activos que contienen células B proliferantes.

Verificación de Compatibilidad de Tinción con Anticuerpo y ARN de Hibridación in situ

Usando muestras de tejido amigdalino de cerdos, ganado vacuno y ciervo de cola blanca, se verificó la compatibilidad de los anticuerpos seleccionados con tecnología RNAscope ARN de hibridación in situ a través de tinción fluorescente. El experimento detectó simultáneamente cada marcador proteico con gen UBC's ARN 'de mantenimiento', y mostró imágenes en escala de grises de canales simples de cada marcador. En las tres especies, las señales de tinción proteica de todos los anticuerpos probados pudieron co-localizarse claramente con señales UBC ARN sin interferencia obvia. Esto prueba que los anticuerpos seleccionados son compatibles con tecnología de hibridación in situ ARN, proporcionando una base clave para el posterior desarrollo de esquemas multiplex in-situ para "proteína-ARN co-detección".

Aplicación de Proteína-ARN Co-detección en Investigación de Immunopatología

Usando tejido amigdalino de cerdos infectados por SVA como muestras, la distribución de ARN específico de SVA en el tejido fue demostrada primero a través de display cromogénico, mostrando que el ARN viral estaba principalmente concentrado en la parenquima intersticial folicular subepitelial y áreas circundantes, aclarando el área de localización de infección del virus en el tejido. Luego la tinción fluorescente multiplex detectó simultáneamente marcadores proteicos con SVA ARN, y mostró imágenes en escala de grises de canales simples de las áreas clave. Los resultados experimentales encontraron que los señales de ARN del virus Seneca A 's RNA 'y señales proteicas objetivo pudieron localizarse con precisión en las mismas células. Esto no solo prueba que el método de detección combinada "detección de anticuerpo + ARN de hibridación in situ" es confiable y efectivo, sino que también muestra claramente que este virus tiende a infectar qué tipo de células. Este método proporciona un enfoque técnico completamente nuevo para estudiar los mecanismos immunopatológicos de enfermedades infecciosas en el campo veterinario.

IV. Resumen

Esta investigación aborda los puntos de dolor centrales de la escasez de inmunorreguladores compatibles con especies y dificultad en detección multiplex de marcadores en investigación in-situ veterinaria. A través del cribado sistemático y verificación, se estableció exitosamente un conjunto de técnicas de tinción in-situ multiplex que pueden ser utilizadas en múltiples especies veterinarias incluyendo cerdos, ganado vacuno y ciervo, incluyendo tinción IHC de campo brillante multiplex, tinción IHC multiplex fluorescente, y esquemas de detección in-situ integrada proteína-ARN. Además, los anticuerpos seleccionados tienen reactividad conservada entre especies, pueden reconocer con precisión marcadores celulares objetivo, métodos de tinción multiplex pueden aclarar paisajes tisulares inmunes y estados funcionales celulares, y co-detección proteína y ARN puede identificar efectivamente tipos de células objetivo de infección patógena. Estos logros de investigación no solo resuelven dificultades técnicas en investigación in-situ veterinaria tradicional, sino que también proporcionan herramientas metodológicas estandarizadas para estudios comparativos de características tisulares e immunopatología entre diferentes especies animales. Al mismo tiempo, también sientan una base técnica importante para investigaciones posteriores sobre las causas de enfermedades infecciosas veterinarias y cribado de marcadores diagnósticos de enfermedad.

Referencias

Wiarda JE, Zanella EL, Shircliff AL, Cassmann ED, Loving CL, Buckley AC, Palmer MV. Tinción in situ con anticuerpos que reaccionan cruzadamente en cerdos, ganado vacuno y ciervos de cola blanca facilita la comprensión del estado tisular biológico e immunopatología. Vet Immunol Immunopathol. 2025 Ene;279:110865. doi: 10.1016/j.vetimm.2024.110865. Epub 2024 Dic 12. PMID: 39719720.   

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