Compartir literatura: Tinción de inmunofluorescencia múltiple del microambiente inmune tumoral del cáncer colorrectal

Literatura Compartiendo

Antecedentes

El microambiente inmune tumoral (TME) del cáncer de colon contiene biomarcadores clave para las respuestas inmunes anti-tumorales del huésped y mecanismos de escape inmune al tumor. La densidad de subpoblaciones de células T, como CD3⁺ y CD8⁺ T cells, se ha demostrado que predice con mayor precisión el riesgo de recurrencia de la enfermedad que el estadificación histopatológica tradicional. Además, las células T residentes en tejidos (tissue-resident memory T cells) que expresan CD103 juegan roles importantes en la inmunidad anti-tumoral para el cáncer de colon y otros tumores, correlacionándose su densidad con los resultados oncológicos a largo plazo. Por lo tanto, la caracterización precisa del fenotipo, función y distribución espacial de las células inmunes en el TME es crucial para descubrir nuevos marcadores pronósticos y guiar estrategias de inmunoterapéuticas. Sin embargo, la inmunohistoquímica cromogénica (IHC) tradicional tiene limitaciones como detección limitada de marcadores, dificultad para el análisis de co-localización, propenso a desviaciones en los resultados y ser laborioso. La inmunofluorescencia multiplex (mIF) puede evaluar simultáneamente múltiples marcadores, permitiendo una clasificación precisa de las células inmunes y análisis de características espaciales con tejidos tumorales, proporcionando una herramienta ideal para la investigación del TME. La tecnología mIF basada en TSA no requiere considerar especies de anticuerpos primarios o subclases de inmunoglobulinas, y tiene alta sensibilidad y brillo de señal, superior a la inmunofluorescencia indirecta tradicional.

Por lo tanto, el estudio de Cohen R et al. "Optimising multiplex immunofluorescence staining for characterising the tumour immune micro-environment" optimizó el proceso para caracterizar precisamente las células inmunes en el cáncer de colon TME utilizando un sistema de detección de 5 colores TSA-mIF basado en una plataforma de tinción automatizada y un escáner de fluorescencia convencional.

Diseño Experimental

El estudio utilizó microarreglos de tejido conteniendo epitelio colónico sano, adenomas de colon de diferentes grados y adenocarcinomas, así como tejidos de cáncer de colon, como muestras. Los marcadores de detección principales fueron CD3, CD8, CD103 y citoqueratina (CK), con DAPI como marcador de tinción nuclear. Primero, se optimizaron las concentraciones de anticuerpos primarios mediante IHC cromogénico, seguido de verificación de tinción fluorescente monocolor basada en tecnología TSA. Luego, se evaluó el crosstalk espectral de los fluoróforos diferentes en cada canal del escáner de fluorescencia convencional, y se exploró el efecto de diferentes órdenes de tinción de marcadores sobre la intensidad de señal. Finalmente, se determinó el orden óptimo de tinción. El proceso de tinción dependió de una plataforma de tinción automatizada, y se adoptó una estrategia de adición de fluoróforo doble-asignación, estableciéndose experimentos de control. StrataQuest v.7.1 software fue utilizado para el análisis de imágenes: primero, máscaras para regiones epiteliales y estromales se generaron basadas en señales CK, luego segmentación nuclear se realizó utilizando señales DAPI para identificar células individuales, seguido de superponer señales CD3, CD8 y CD103. Finalmente, la densidad de células objetivo en diferentes regiones fue analizada cuantitativamente, y verificación de repetibilidad se logró calculando el coeficiente de correlación de consistencia.

Optimización de Concentración de Anticuerpos Primarios y Verificación de Tinción Fluorescente Monocolor

Cuatro marcadores de detección, CD3, CD8, CD103 y CK, fueron teñidos con DAB, con anticuerpos primarios establecidos en diferentes proporciones de dilución y tiempos de incubación. Basado en las condiciones optimizadas de anticuerpos primarios del IHC cromogénico, CD3, CD8 y CD103 fueron marcados con Opal 620, y CK fue marcado con TSA-Cy5 para tinción fluorescente monocolor. Los resultados fueron consistentes con el teñido de IHC.

Evaluación de Crosstalk Espectral de Fluoróforos en Tinción Fluorescente Monocolor

El crosstalk espectral fue evaluado cuidadosamente para cada combinación anticuerpo-fluoróforo en detección multiplex. Secciones de tinción monocolor se escanearon en todos los canales para determinar la presencia de crosstalk espectral. CD8-TSA Cy3 mostró ligero crosstalk al canal SpRed, y CD103-Opal Polaris 780 mostró ligero crosstalk al canal Cy5. Estos resultados proporcionaron base clave para asignación posterior de fluoróforos y optimización del orden de tinción, e impacto del crosstalk en clasificación celular podría evitarse mediante emparejamiento razonable de marcador-fluoróforo y establecimiento umbral de intensidad de señal.

Asignación de Fluoróforos y Determinación del Orden de Tinción

Respecto a la asignación de fluoróforos, primero, para abordar la dificultad de eluir anticuerpos CD103 y evitar impacto sobre tejido y señales en pasos subsiguientes, se estableció como la última tinción en detección multiplex, emparejada con el fluoróforo Opal Polaris 780. Tres marcadores, CD8-Opal 620, CD3-Cy3 y CK-Cy5, fueron colocados en posiciones 1, 2 y 3 de la secuencia de tinción mIF, con un total de 6 permutaciones. Al comparar la intensidad de señal de cada marcador en diferentes posiciones de tinción, se identificó el orden óptimo: CK-Cy5 permaneció más estable en las tres posiciones, CD8-Opal 620 tuvo la intensidad de señal más fuerte cuando se teñió tercero, y CD3-Cy3 tuvo la señal más débil cuando se teñió primero. Finalmente, el orden general de tinción se determinó como CK→CD3→CD8→CD103.

Resultados de Inmunofluorescencia Multiplex

Evaluación histopatológica tradicional de actividad celular inmune en el microambiente tumoral se basa en patólogos anatómicos entrenados para descripción de características y análisis semicuantitativo de secciones monocromáticas. El surgimiento de software de análisis de imágenes digitales de alto rendimiento ha aprovechado plenamente las ventajas de la tecnología de tinción multiplex, permitiendo identificación automatizada celular basada en máquina, identificación multimarca, localización espacial de fondo y posterior análisis cuantitativo. Este estudio utilizó StrataQuest v.7.1 software de TissueGnostics (Austria) para análisis cuantitativo de células monopositivas, dipositivas y tripositivas. Primero, máscaras para regiones epiteliales y estromales se generaron utilizando señales de citoqueratina, luego células individuales fueron identificadas a través de algoritmos de segmentación nuclear basados en señales DAPI. Posteriormente, basado en la expresión de CD3, CD8 y CD103, la clasificación de células dipositivas y tripositivas fue confirmada por superposición de señales de marcador combinada con tecnología backgating. Finalmente, conteos regionales y datos de medición de área de células objetivo fueron obtenidos mediante cuantificación computacional.

Referencias

Cohen R, Lee-Pullen T, Miller TJ, Meehan K, Fuller K, McCoy MJ. Optimising multiplex immunofluorescence staining for characterising the tumour immune micro-environment. Methods. 2023 Nov;219:48-57. doi: 10.1016/j.ymeth.2023.09.004. Epub 2023 Sep 21. PMID: 37741563.    

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