Compartir Literatura: Inmunofluorescencia Múltiple para la Predicción de la Eficacia Terapéutica de ICI en el Cáncer de Mama Temprano

Compartición de Literatura: Inmunofluorescencia Multiplex para Predicción de Eficacia Terapéutica del Cáncer de Mama ICI Terapéutica

Antecedentes

En los últimos años, los inhibidores de puntos de control inmunitario (ICI) han mostrado un valor potencial en el tratamiento del cáncer de mama, pero las respuestas al tratamiento varían significativamente entre diferentes pacientes. Las características del microambiente inmune tumoral (TIME) son factores clave que afectan la eficacia de los ICI. Actualmente, aún existe una falta de definición sistemática y precisa de biomarcadores predictivos de respuesta a la terapia con inhibidores PD-L1 en pacientes con cáncer de mama, especialmente las diferencias en los mecanismos de respuesta al tratamiento entre diferentes subtipos receptores del cáncer de mama no han sido completamente elucidados. Las nuevas tecnologías de detección desarrolladas en los últimos años pueden evaluar simultáneamente múltiples marcadores mientras preservan completamente las relaciones espaciales de las células in situ, y se están aplicando ampliamente a la caracterización del microambiente inmune tumoral y al análisis de biomarcadores relacionados con inmunidad. Entre estos, tecnología de inmunofluorescencia multiplex (mIF) ha demostrado valor aplicativo en la predicción de eficacia ICI en varios tumores, superando significativamente las firmas de expresión génica, carga mutacional tumoral y detección estandarizada de inmunohistoquímica PD-L1. Basado en este contexto, el estudio "Biomarcadores multiplataforma de respuesta a un inhibidor de puntos de control inmunitario en el ensayo neoadyuvante I-SPY 2 para cáncer de mama en etapas tempranas" analizó la densidad y las características de distribución espacial de células inmunes en el microambiente tumoral de pacientes tratados con quimioterapia neoadyuvante ± pembrolizumab a través de detección por inmunofluorescencia multiplex. Combinado con perfilación de expresión génica y tecnología de array inverso proteico, exploró vías de señalización inmune y biomarcadores relacionados con defectos en reparación del ADN, proporcionando finalmente evidencia importante para la criba clínica precisa de poblaciones que se benefician del tratamiento ICI y optimización de estrategias de inmunoterapia en cáncer de mama temprano.

Métodos de Investigación

El kit de inmunohistoquímica fluorescente Opal 7-colores se utilizó para realizar tinción por inmunofluorescencia multiplex en secciones de 4μm de tejido tumoral fijado con formalina e incrustado en parafina pre-tratamiento. El proceso implicó recuperación de epítopos inducida por calor (HIER), incubación con anticuerpos primarios, incubación con anticuerpo secundario marcado con HRP y amplificación de señal de tirosamina con desarrollo de fluoróforos Opal. Se realizaron posteriores flujos de tinción repetidos tras la eliminación de HIER de los anticuerpos unidos, seguido de tinción DAPI y montaje. Las secuencias de etiquetado de anticuerpos se determinaron basándose en la estabilidad del antígeno a HIER repetido, y el emparejamiento de tintas fluorescentes equilibró la intensidad de tinción con localización celular para reducir el cruce de señales. Las secciones fueron imaged usando un escáner Vectra 3.0, con 15-20 imágenes multispectrales a magnificación de 20x recolectadas por muestra de biopsia tumoral. El desmeixado espectral y segmentación celular se completó usando software patología cuantitativa inForm.To analizar relaciones espaciales entre fenotipos celulares específicos, este estudio empleó análisis de patrón espacial de puntos usando paquetes R como phenoptr, spatstat, y divo. Cada imagen de inmunofluorescencia multiplex fue virtualmente dividida en cuadrados no superpuestos 200μm×200μm, y se contaron los números de células cancerígenas y células inmunes dentro de cada cuadrado. El índice de similitud Morisita-Horn (MH) del paquete R divo fue entonces utilizado para calcular el grado de colocalización entre 21 grupos de tipos celulares. El índice MH varía desde 0 a 1, donde 0 representa alta separación entre tipos celulares A y B.

Identificación de Infiltración Celular Inmune en Tejido de Cáncer de Mama mediante mIF

El estudio desarrolló dos paneles de detección por inmunofluorescencia multiplex para analizar infiltración celular inmune en muestras de biopsia pre-tratamiento. Algoritmos de gateado automatizados completaron identificación de fenotipo celular y generaron mapas de fenotipo para análisis espacial posterior. Los resultados mostraron diferencias significativas en densidad celular inmune entre diferentes tumores, con células inmunes constituyendo 1%-68% de células totales. Entre estos, T células, B células y macrófagos constituyeron < 1%-42%, <1%-22% y <1%-43% respectivamente. Se encontraron correlaciones significativas entre T células, B células y densidad de Treg, mientras que densidad de macrófagos y mastocitos no mostró asociación con estas poblaciones linfoides. Adicionalmente, niveles de tinción PD-1/PD-L1 también exhibieron heterogeneidad evidente, con PD-1+ T células constituyendo < 0.04%-3.9% de células totales, y células PD-L1+ constituyendo < 0.06%-2.6%.

Asociación de Biomarcadores Relacionados con Células Inmunes con Respuesta al Tratamiento

Este estudio analizó el rol predictivo de indicadores relacionados con células inmunes sobre respuesta patológica completa post-tratamiento (pCR) en diferentes tipos de pacientes con cáncer de mama en grupo de tratamiento con pembrolizumab y grupo control quimioterapia convencional. Los resultados mostraron que indicadores que predicen eficacia terapéutica en el grupo de pembrolizumab fueron mucho más numerosos que en el grupo control, e indicadores efectivos predictivos diferían entre diferentes tipos de cáncer de mama. Específicamente, entre 20 indicadores relacionados con células inmunes detectados por tecnología de inmunofluorescencia multiplex, 8 mostraron correlación positiva significativa con eficacia tratamiento pembrolizumab, incluyendo linfocitos infiltrantes tumorales (TILs), varias T células, dos tipos de células expresantes PD-L1, y puntaje PD-L1 CPS. Valores más altos de estos indicadores se asociaron con mayor probabilidad de desaparición completa del tumor, mientras que en el grupo control, solo TILs, T células y B células mostraron asociaciones débiles con eficacia. Entre los 18 indicadores relacionados con genes analizados, 11 solo podían predecir eficacia tratamiento pembrolizumab, cubriendo firmas génicas correspondientes a varias células inmunes y genes codificantes para PD-1 y PD-L1. Entre 11 proteínas inmunes relacionadas detectadas por tecnología detección proteica, solo proteína HLADRPQX se asoció con eficacia tratamiento pembrolizumab. De entre los 49 indicadores inmunes totales, 20 podían claramente predecir eficacia inmunoterapia, mientras que el grupo control mostró solo 6 indicadores con asociaciones no claras con eficacia. Entre estos, firmas génicas relacionadas con células dendríticas mostraron mejor eficacia predictiva, mientras que firmas génicas relacionadas con mastocitos mostraron correlación negativa con eficacia. En cáncer de mama triplo negativo, 3 indicadores podían claramente predecir eficacia inmunoterapia y 8 indicadores mostraron ciertas asociaciones, involucrando principalmente células inmunes expresantes PD-L1 y dos firmas génicas. En cáncer de mama HR+HER2-, 10 indicadores podían claramente predecir eficacia y 9 indicadores mostraron ciertas asociaciones, incluyendo proteína HLADRPQX y varias células inmunes. Importante, estos indicadores que predicen eficacia inmunoterapia no mostraron asociación con eficacia tratamiento en sus respectivos grupos control.

Correlación de Colocalización Célula Inmune y Célula Tumoral con Respuesta a Pembrolizumab

El estudio exploró diferencias de proximidad espacial entre respondedores y no respondedores entre varias poblaciones celulares inmunes y células tumorales u otras células inmunes, usando índice MH y función distribución vecino más cercano para análisis de proximidad espacial. Los resultados mostraron que indicadores relacionados con índice MH se asociaron significativamente con respuesta tratamiento pembrolizumab y se concentraron en colocalización celular relacionada PD-1/PD-L1, mostrando especificidad de subtipo.

Específicamente, el índice MH mide grado de colocalización entre dos tipos celulares, variando desde 0 a 1. Cuando dos tipos celulares están altamente colocalizados, el índice se acerca a 1, y cuando altamente separados, se acerca a 0. El estudio calculó índices MH para 21 grupos de tipos celulares. Altos índices MH entre células T y reguladoras T (Tregs) se asociaron significativamente con respuesta tratamiento pembrolizumab en cohorte total. Altos índices MH entre células PD-1+ T y células PD-L1+ también se asociaron con pCR. Tras corrección múltiples pruebas, 8 de 21 índices MH se asociaron con respuesta tratamiento pembrolizumab en cohorte total pero no con grupo control. Entre estos, 6 involucraron colocalización celular relacionada PD-1/PD-L1, y 3 mostraron interacciones significativas con tratamiento. Cuando analizado por subtipo receptor, 7 índices MH fueron correlacionados positivamente con grupo pembrolizumab pCR y no relacionados con grupo control. Estos índices fueron todos relacionados con colocalización celular relacionada PD-1/PD-L1 y altamente correlacionados entre sí. Entre estos, colocalización células PD-1+ T con células PD-L1+ o células tumorales PD-L1+, y colocalización células citotóxicas PD-1+ CD8+ T con células PD-L1+ se asociaron con pCR en tanto tumores triplo negativos como HR+HER2-.

Correlación de Proximidad Espacial entre Células Inmunes y Células Tumoral con Respuesta a Pembrolizumab

El estudio investigó adicionalmente proximidad espacial entre células inmunes y células tumorales usando análisis patrón punto espacial y funciones distribución vecino más cercano. Resultados indicaron que en pacientes tratados con pembrolizumab, proximidad espacial más cercana entre ciertas poblaciones celulares inmunes y células tumorales se asoció con mejor respuesta tratamiento. Específicamente, proximidad espacial entre células PD-1+ T y células tumorales PD-L1+ mostró correlación más fuerte con pCR, particularmente en cáncer de mama triplo negativo. Adicionalmente, el estudio encontró que proximidad espacial entre células dendríticas y células tumorales también se asoció con respuesta tratamiento pembrolizumab, sugiriendo un rol potencial para presentación antígeno en eficacia ICI. Estos hallazgos resaltan importancia de relaciones espaciales dentro del microambiente inmune tumoral en determinar respuesta tratamiento a inhibidores puntos de control inmunitario.

Referencias    

Campbell MJ, Wolf DM, Yau C, Brown-Swigart L, Wulfkuhle J, Gallagher IR, Zhu Z, Bolen J, Vandenberg S, Hoyt C, Mori H, Borowsky A, Sit L, Perlmutter J, Asare SM; I-SPY2 Investigadores; Nanda R, Liu MC, Yee D, DeMichele AM, Hylton NM, Pusztai L, Berry DA, Hirst GL, Petricoin EF, Veer LV, Esserman L. Biomarcadores multiplataforma de respuesta a un inhibidor de puntos de control inmunitario en el ensayo neoadyuvante I-SPY 2 para cáncer de mama en etapas tempranas. Cell Rep Med. 19 nov 2024;5(11):101799. doi: 10.1016/j.xcrm.2024.101799. Epub 6 nov 2024. PMID: 39510069; PMCID: PMC11604542.  

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