Preguntas Frecuentes sobre la Preparación de Anticuerpos – Células Híbridoma
En el campo de la preparación de anticuerpos monoclonales, la fusión celular es un eslabón clave para obtener células híbridoma. El objetivo es fusionar linfocitos B y células mieloma entre sí para que los materiales genéticos de ambas células puedan recombinarse mutuamente. Las células híbridomas obtenidas de esta manera no solo pueden mantener la función de las células B en la secreción de anticuerpos, sino también adquirir las características de proliferación ilimitada de las células de mielo.
Pasos de fusión celular
1. Cultivo de células mieloma: Líneas celulares mieloma como SP2/0, NS0 o P3 - X63 - Ag8.653 provenientes de ratón. Para el cultivo, se utilizó medio RPMI 1640 o DMEM que contiene un 10% de suero fetal bovino (FBS) a 37°C al 5% CO₂. Deben seleccionarse células en la etapa de crecimiento logarítmico, y la viabilidad debe alcanzar más del 95%, y la morfología celular debe ser redondeada y bien dispersa. Las células deben pasarse (subcultivarse) 1-2 días antes de la fusión para evitar el envejecimiento celular, y las células deben lavarse con medio libre de suero 3 veces antes de la fusión para eliminar componentes del suero que podrían afectar la fusión.
2. Preparación de splenocitos: 3-4 días después de la última inmunización, cuando el número de células B específicas del antígeno en bazo es el mayor, se toma el material en este momento. La operación específica consiste en extraer el bazo del ratón inmunizado bajo condiciones estériles, cortarlo con tijeras y triturarlo a través de un tamiz celular de 200 mallas para obtener una suspensión monocelular. Luego, la suspensión celular se centrifugó a 1000 rpm durante 5 minutos. Se vació el sobrenadante, se lavaron las células dos veces con medio libre de suero y se realizó un recuento celular.
3. Mezcla de células y centrifugación: Mezclar splenocitos y células mieloma en una proporción de 5:1 a 10:1. Centrifugar la suspensión celular mezclada a 1000 rpm durante 5 minutos, vaciar el sobrenadante después de la centrifugación y luego agitar suavemente el fondo del tubo para aflojar el pelote celular y evitar que la aglomeración celular afecte el efecto de fusión posterior.
4. Fusión inducida por PEG: Pre-calentar medio libre de suero y PEG al 50% a 37°C primero. Añadir lentamente 1 mL de PEG al 50% al pelote celular durante 1 minuto a 37°C, agitando suavemente el tubo para permitir que el PEG contacte con las células uniformemente. Después de completar la gota, dejar reposar a 37°C durante 1 - 2 minutos; hacerlo demasiado tiempo puede aumentar la mortalidad celular.
5. Terminación de la reacción de fusión: Una vez completada la reacción, añadir 10ml medio DMEM que contiene un 10% FBS para terminar la reacción, añadiendo gradualmente desde lento a rápido y adding todas las reacciones en 6 minutos. Agitar suavemente el tubo mientras se añade para diluir gradualmente el PEG y reducir su toxicidad para las células. Centrifugar a 1000 rpm durante 5 minutos, desechar el sobrenadante y resuspender las células con medio completo que contiene HAT.
6. Incubación y cribado: Inocular la suspensión celular fusionada en una placa de cultivo celular de 96 pocillos, añadiendo 105 células por pocillo para asegurar una densidad celular adecuada para el cribado HAT posterior. Colocar la placa de cultivo en un incubador termostatizado ajustado a 37°C con un 5% CO₂, y cultivar las células en un medio completo que contiene HAT. Después de cultivar durante 3–7 días, aspirar y desechar el sobrenadante de cultivo, luego reemplazar el medio según el estado del crecimiento celular. Después del reemplazo del medio, prestar atención a observar la morfología celular y el crecimiento celular. Realizar ELISA para realizar detección de cribado positivo 2–3 días después.
Preguntas Comunes
1. Pocos Clones Después de la Fusión
(1) La viabilidad celular insuficiente es la causa principal. La viabilidad de los linfocitos B inmunizados puede disminuir debido al estado inmunitario deficiente del animal o al tiempo inadecuado de recolección de sangre; por el contrario, las células mieloma pueden experimentar una capacidad de proliferación reducida debido a la contaminación durante el cultivo o pasajes excesivos. Ambos escenarios afectan directamente la tasa de éxito de la fusión.
(2) Proporción desequilibrada de los dos tipos celulares puede ser un factor. Típicamente, la proporción óptima de células B a células mieloma oscila entre 5:1 y 10:1. Una proporción excesivamente alta o baja llevará a una interacción insuficiente entre las células, fallando en formar un número adecuado de células híbridoma.
(3) Los detalles del proceso operativo de fusión requieren atención. En el método de fusión por PEG comúnmente utilizado, la calidad y concentración del PEG son factores influyentes centrales: la pureza insuficiente del PEG introduce toxicidad por impurezas, una concentración excesivamente alta causa daño fatal a las células, y una concentración demasiado baja no logra inducir efectivamente la fusión de membranas celulares. Al mismo tiempo, el control inadecuado de temperatura durante la fusión también puede causar problemas: temperaturas excesivamente altas aceleran la apoptosis celular, mientras que temperaturas demasiado bajas inhiben la fluidez de las membranas celulares e impiden el proceso de fusión.
(4) Problema con la densidad de incubación: Se recomienda que el número total de células sembradas en cada pocillo de una placa de 96 pocillos sea 105.
2. No se Detectaron Clones Positivos Después de la Fusión
(1) La sensibilidad insuficiente del método de detección no permite identificar clones positivos con baja secreción de anticuerpos. Por ejemplo, en el experimento ELISA, esto puede deberse a una concentración excesivamente baja del antígeno recubierto, actividad deficiente del anticuerpo secundario etiquetado con enzima, o sustrato cromógeno inactivado.
(2) La especificidad insuficiente del método de detección lleva a interferencias por señales variadas. La ausencia de controles negativos y positivos diseñados adecuadamente puede causar un juicio erróneo de resultados negativos.
(3) Clústeres fusionados excesivamente pequeños resultan en secreción de anticuerpos insuficiente (demasiado poco anticuerpo producido para ser detectado).
(4) Los clústeres celulares en crecimiento son ya sea células falsamente fusionadas o clústeres celulares anómalos (que no secretan el anticuerpo específico objetivo, por lo tanto, no se identifican como clones positivos).
3. Señales Positivas en Todos los Pocillos Detectados Después de la Fusión
(1) Especificidad insuficiente del método y reactivos de detección. Por ejemplo, baja especificidad del anticuerpo secundario, concentración excesivamente alta o pureza insuficiente del antígeno recubierto, especificidad cromógena demasiado fuerte, tiempo cromógeno prolongado, o temperatura cromógena excesivamente alta. Por lo tanto, se deben establecer simultáneamente pocillos de control negativo y positivo durante la detección.
(2) Enriquecimiento nutricional del medio conduce a un tiempo de supervivencia excesivamente largo de células no fusionadas, que secretan grandes cantidades de anticuerpos positivos en los pocillos. El medio debe ser reemplazado antes de realizar la detección nuevamente.
(3) Colónias celulares excesivas en cada pocillo de la placa celular. Las células deben diluirse y transferirse a una nueva placa para cultivo; una vez que crecen, debe realizarse la detección nuevamente.
4. Crecimiento Lento de las Células Fusionadas
(1) El medio de cultivo, especialmente el suero, no es adecuado para el crecimiento celular. Es esencial seleccionar sueros de alta calidad que sean adecuados para el crecimiento de híbromas.
(2) Los consumibles de cultivo no son amigables con las células.
(3) Las células están contaminadas, por ejemplo, por micoplasma, lo que a veces puede incluso llevar a la muerte celular.
(4) Algunos células individuales tienen requisitos nutricionales especiales, haciendo que sea difícil su crecimiento o causando un crecimiento lento; sin embargo, tienen una fuerte capacidad para secretar anticuerpos, y se puede detectar una señal fuerte incluso con solo unas pocas de estas células en un pocillo. Esto puede juzgarse después de determinar el título del sobrenadante.
5. Clones Positivos se Convierten en Negativos Después de Varias Rondas de Subclonación
(1) La línea celular es impura y las células no secretoras dominan. Durante el proceso de subclonación, las células positivas pueden fallar en sembrarse en los pocillos celulares, o incluso si se siembran a tiempo, los clones fallan en crecer.
(2) La línea celular es inestable y propensa a pérdida de cromosomas. Usar el método de dilución limitante o la tecnología de clasificación de células individuales para realizar al menos 2–3 rondas de subclonación, y detectar regularmente el nivel de secreción del anticuerpo y la especificidad. Eliminar clones con un descenso rápido en el título de anticuerpo o especificidad alterada durante el pasaje, y retener líneas celulares con función de secreción estable.
(3) El entorno de crecimiento celular es desfavorable. Por ejemplo, al intentar rescatar células en condiciones pobres, muchas células ya pueden haber sufrido degeneración.
(4) Después de la contaminación celular, las células también pueden dejar de secretar anticuerpos; el caso más típico es la contaminación por micoplasma.
6. Híbridomas Inyectados en Peritoneo de Ratón Fallan en Producir Ascitis, Solo Forman Tumores Sólidos, o la Ascitis Producida No Tiene Título
(1) Se selecciona una cepa de ratón inadecuada. La función inmunitaria anormal en el propio ratón puede desencadenar una respuesta inflamatoria intraperitoneal, lo que dificulta la producción de ascitis o lleva a la formación de tumores sólidos.
(2) Dosis insuficiente del sensibilizador, método de inyección incorrecto o intervalo excesivamente largo (más de 7–14 días) después de la sensibilización resultará en un efecto de sensibilización deficiente.
(3) El número de células inyectadas en el peritoneo es insuficiente. Cada ratón debe ser inyectado con 10⁵–10⁶ células cada vez, suspendidas en PBS esterilizado o medio incompleto.
(4) La razón de la formación excesiva de tumores sólidos puede ser que durante la inyección, el tejido subcutáneo abdominal, músculo o intestino son punzados, y las células no se inyectan completamente en el peritoneo. La técnica de inyección es crucial.
(5) El anticuerpo producido por el híbroma se une específicamente a cierta molécula en el cuerpo del ratón, resultando en neutralización del anticuerpo producido. La proteína objetivo contra la cual están dirigidos estos anticuerpos tiene una alta homología de secuencia con las sustancias proteicas propias del ratón.
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