El sistema de expresión de Escherichia coli es un pilar fundamental en la producción de proteínas recombinantes, valorado por sus vías metabólicas bien caracterizadas, rápido crecimiento celular, altos niveles de expresión proteica y fondo genético claro. A pesar de estas ventajas, el principal desafío al utilizar este sistema es la tendencia a la agregación de proteínas en cuerpos de inclusión. Estos agregados insolubles a menudo carecen de actividad biológica, planteando un obstáculo considerable para los investigadores que buscan obtener proteínas funcionales. En este artículo, presentamos cinco estrategias esenciales para mejorar la solubilidad de las proteínas recombinantes en E. coli y mitigar la formación de cuerpos de inclusión.

1. Eliminación de Péptidos Señal

Los péptidos señal, que típicamente consisten en 5-30 aminoácidos, juegan un papel crucial en la guía de las proteínas recién sintetizadas a través de vías secretoras y facilitan su plegamiento en estructuras tridimensionales específicas. También determinan la localización final de las proteínas en compartimentos subcelulares específicos. En el contexto de la expresión proteica intracelular en E. coli, los péptidos señal son a menudo redundantes funcionalmente y pueden incluso ser perjudiciales. La naturaleza hidrofóbica de los péptidos señal puede inducir la agregación de proteínas y la formación de cuerpos de inclusión. Por lo tanto, se recomienda eliminar los péptidos señal de la secuencia de la proteína objetivo para promover una expresión soluble en E. coli (Baneyx, 1999).

2. Optimización del Códon

Durante la síntesis de proteínas, las tRNAs con códones correspondientes guían los aminoácidos al ARNm para la traducción. En sistemas procarióticos, la abundancia diferencial de tRNAs lleva a un sesgo del códon. E. coli contiene ocho códores raros: AGA, AGG, CGG, CGA, AUA, CUA, GGA y CCC. Si el gen de interés es de tipo salvaje (wild-type), se aconseja analizar primero la frecuencia de los códores raros. Para genes con una baja frecuencia de códores raros, usar una cepa Rosetta puede mejorar la expresión. Sin embargo, si el gen contiene una alta frecuencia de códores raros, la optimización del códon seguida por la síntesis génica es el mejor enfoque. La optimización del códon implica seleccionar códores que se usan con mayor frecuencia en E. coli (generalmente aquellos con una frecuencia de uso >20%). Este proceso puede mejorar la estabilidad de las estructuras secundarias del ARNm y prevenir retrasos en la traducción, terminación prematura, desplazamientos del marco y desacoples de aminoácidos causados por pools insuficientes de tRNAs (Gustafsson et al., 2004).

3. Selección de Vectores de Expresión Adecuados

Incluso con una secuencia génica optimizada, lograr la expresión soluble de proteínas requiere el vector de expresión adecuado. La serie pET28 es ampliamente aplicable para diversas proteínas. El vector pET22b puede dirigir la secreción de proteínas objetivo al espacio periplasmático, lo que facilita la formación de enlaces disulfuro y un plegamiento proteico adecuado, mejorando así la solubilidad. Los sistemas de fusión como pGEX4T, pET32 y pET43.1 también pueden mejorar la solubilidad incorporando etiquetas de fusión que promueven la solubilidad. Además, las series de vectores pCold y pBAD son excelentes opciones para optimizar las condiciones de expresión proteica (Rosano y Ceccarelli, 2014).

4. Elección de Cepas de Expresión Adecuadas

Después de seleccionar el vector de expresión adecuado, el siguiente paso es elegir la cepa correcta de E. coli para la expresión proteica. La cepa BL21 se usa comúnmente para la expresión rutinaria de proteínas. La cepa T7E puede mejorar los niveles de expresión proteica. La cepa Origami está diseñada para promover la formación de enlaces disulfuro dentro del citoplasma. La cepa Arctic permite la inducción a 12°C, lo que puede mejorar la solubilidad y actividad de las proteínas (Takai et al., 2001).

5. Optimización de Condiciones de Expresión

Lograr la expresión soluble de proteínas requiere un enfoque integral que considere todos los aspectos del sistema de expresión. Esto incluye probar la compatibilidad de los vectores de expresión con diferentes cepas de E. coli y optimizar las condiciones de inducción, como seleccionar el medio de cultivo adecuado, ajustar la temperatura de inducción y afinar las concentraciones de inductores. Estas optimizaciones pueden reducir significativamente la formación de cuerpos de inclusión (Baneyx y Mujacic, 2004).

Conclusión

Aunque la formación de cuerpos de inclusión es un desafío común en la expresión proteica de E. coli, no siempre representa una desventaja. Los cuerpos de inclusión a menudo arrojan altos niveles de expresión proteica y son más fáciles de purificar, haciéndolos una opción adecuada para aplicaciones como la producción de anticuerpos para Western blotting. Sin embargo, para obtener proteínas biológicamente activas, las estrategias descritas anteriormente pueden mejorar significativamente la solubilidad y funcionalidad de las proteínas. Al considerar cuidadosamente la eliminación de péptidos señal, la optimización del códon, la selección de vectores y cepas adecuados, y la optimización de las condiciones de expresión, los investigadores pueden superar efectivamente los desafíos planteados por los cuerpos de inclusión y lograr una expresión proteica exitosa en sistemas de E. coli.