Detección de Inmunohistoquímica (IHC) en Muestras Congeladas
1. Incrustación de Tejido en OCT
Propósito: Incrustar muestras de tejido con compuesto OCT y congelar para un posterior corte y fijación.
Materiales:
- Muestras de tejido
- Isopentano
- Hielo seco
- Compuesto OCT
- Moldes de incrustación
Procedimiento:
Preparar un recipiente metálico, llenarlo parcialmente con isopentano y colocarlo sobre hielo seco, dejar enfriar durante 5 minutos.
Colocar el tejido fresco en el molde de incrustación y rellenar con compuesto OCT, ajustando la orientación del tejido.
Posicionar el molde sobre el recipiente de isopentano refrigerado durante 10-20 segundos hasta que el bloque de tejido se vuelva opaco, evitando el contacto directo entre el isopentano y el OCT.
Almacenar los bloques de tejido congelados en un congelador a -80°C para uso futuro, o a -20°C para almacenamiento a corto plazo.
2. Corte de Secciones
Propósito: Cortar el tejido incrustado en secciones finas y montarlas sobre portaobjetos.
Materiales:
- Muestras de tejido incrustadas en OCT
- Portaobjetos microscópicos
- Crioestato y hojas de corte
Procedimiento:
Colocar el tejido incrustado en OCT dentro del chambero del crioestato a -20°C para igualación de temperatura (30min-1h). Para tejidos más grandes o tipos especiales, extender hasta 2h si es necesario.
Fijar el bloque de tejido congelado sobre el soporte de especímenes.
Ajustar la hoja del crioestato, asegurar una fijación adecuada y establecer un ángulo de corte apropiado.
Recortar el bloque de tejido para exponer la superficie del tejido, típicamente con un espesor de 10-30μm.
Cortar secciones a un espesor de 5-20μm (ajustar según el experimento), desechar las secciones iniciales potencialmente problemáticas.
Transferir las secciones al portaobjetos utilizando un pincel, prepararse para los siguientes pasos de fijación.
3. Fijación
Propósito: Preservar la morfología del tejido mediante tratamiento con fijador.
Materiales:
- Secciones de tejido
- Tampón (PBS)
- Fijadores (formalina tamponada neutra al 10%, paraformaldehído al 4%, acetona o metanol al 100%)
Procedimiento:
Dejar que las secciones de tejido recién cortadas permanezcan a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Seleccionar el fijador apropiado según la diana de detección:
Para proteínas de bajo peso molecular, péptidos y enzimas: formalina tamponada neutra al 10% o paraformaldehído al 4%
Para antígenos proteicos de alto peso molecular: acetona o metanol al 100%
Para antígenos proteicos de alto peso molecular: acetona o metanol al 100%
Inmersión de las secciones de tejido en el fijador, incubación a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Lavar las secciones tres veces con PBS, 3min cada una.
4. Bloqueo
Propósito: Reducir el tincimiento de fondo mediante pasos de bloqueo.
Materiales:
- Secciones de tejido
- Solución de bloqueo (p. ej., suero normal al 2-10%)
- Tampón de lavado (PBS)
Procedimiento:
Lavar los portaobjetos tres veces con PBS, 3min cada una.
Bloquear la actividad endógena de peroxidasa incubando con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos, luego lavar con PBS.
Realizar bloqueo proteico incubando con solución de suero normal para bloqueo durante 30 minutos.
5. Incubación con Anticuerpo
Propósito: Tincionar el tejido con anticuerpos, utilizando tanto anticuerpos primarios directamente conjugados como detección indirecta mediante anticuerpos secundarios.
Materiales:
- Tampón de dilución de anticuerpo
- Tampón de lavado (PBS)
- Anticuerpo primario conjugado
Procedimiento:
Determinar la dilución óptima del anticuerpo según las instrucciones del fabricante y diluir en tampón de dilución de anticuerpo.
Aplicar el anticuerpo primario diluido al tejido, incubación a temperatura ambiente durante 1 hora o a 4°C durante la noche.
Lavar las secciones tres veces con PBS, 3min cada una.
6. Reacción Cromogénica y Microscopía
Propósito: Visualizar los resultados de tinción mediante reacción cromogénica.
Materiales:
- Sustrato cromogénico (p. ej., DAB, AEC)
- Concolorante (opcional, p. ej., hematoxilina)
- Medio de montaje (opcional, p. ej., medio de montaje acuoso)
- Cubreobjetos
- Microscopio
Procedimiento:
Aplicar la solución cromógena preparada a las secciones de tejido, monitorear bajo microscopio hasta que aparezca la señal positiva deseada.
Lavar las secciones tres veces con PBS, 3min cada una.
Aplicar la solución de concolorante a las secciones, incubación a temperatura ambiente durante 2-5 minutos.
Enjuagar los portaobjetos con PBS para eliminar el exceso de tinción y hematoxilina azul.
Aplicar una pequeña cantidad de medio de montaje sobre los portaobjetos.
Colocar cuidadosamente los cubreobjetos sobre las secciones utilizando pinzas, evitando burbujas de aire.
Examinar las secciones bajo microscopio, o almacenar a 4°C si no se observan inmediatamente.
| Jeff Jeff es un experto en productos de patología en EnkiLife, especializado en investigación e desarrollo de productos para inmunohistoquímica durante más de 12 años. Tiene un alto nivel de comprensión sobre las necesidades del usuario y se compromete a ayudar a nuestros clientes a realizar experimentos de inmunohistoquímica y acelerar los descubrimientos científicos. |
