Guía Rápida de 5 Pasos para SeleccionarAnticuerpo de Control de Carga
Control de carga, típicamente una proteína codificada por un gen de mantenimiento. Estas proteínas exhiben una expresión relativamente constante a través de diversos tejidos y células, y se utilizan comúnmente como referencias al detectar cambios en los niveles de expresión de las proteínas objetivo.
Los anticuerpos de control de carga sirven como el "punto de referencia" en los experimentos. Se utilizan para calibrar las diferencias en la cantidad de muestras y evaluar la estabilidad del sistema experimental. Seleccionar el anticuerpo de control de carga adecuado es un paso crucial para garantizar la fiabilidad de los datos, y es particularmente vital para investigaciones sobre expresión génica, cuantificación de proteínas y otros estudios relacionados en la investigación científica universitaria. ¿Cómo seleccionar correctamente el loading control antibody? Los siguientes puntos pueden utilizarse como referencia.
Anticuerpo Monoclonal de GAPDH (Cat: AMRe21263)
1. Origen Especie de las Muestras
El primer factor a considerar es la especie de la cual se derivan las muestras experimentales. Para tejidos o muestras celulares de mamíferos, proteínas como β-actina, Tubulina, GAPDH, Lamin B, PCNA y Na⁺/K⁺-ATPasa suelen seleccionarse. Para muestras experimentales derivadas de plantas, se pueden elegir Actina vegetal, Rubisco, etc. Hay relativamente poca investigación sobre muestras de otras fuentes; por lo tanto, las proteínas apropiadas deben seleccionarse como proteína de control de carga haciendo referencia a los informes de literatura.
2. Peso Molecular de la Proteína Objetivo
Al seleccionar un anticuerpo de control de carga, debe tenerse en cuenta el peso molecular de la proteína objetivo. Generalmente, es necesario asegurarse de que la diferencia de peso molecular entre la proteína objetivo y la proteína de referencia sea al menos 5 kDa. Por ejemplo, si el peso molecular de la proteína objetivo es 40 kDa, β-actina y GAPDH no son opciones adecuadas para loading control proteins en este momento, y Tubulina puede considerarse como una alternativa loading control protein.
3. Nivel de Expresión de la Proteína de Referencia Interna
El seleccionado loading control protein debe estar altamente expresado en las muestras de prueba. Los comúnmente utilizados loading control proteins están altamente expresados por genes de mantenimiento y son esenciales para el desarrollo celular y el mantenimiento de la viabilidad celular.
4. Localización de la Proteína Objetivo
Para el detección general de proteínas, GAPDH, β-actina o β-tubulina pueden cumplir los requisitos. Sin embargo, cuando es necesario detectar proteínas organelas subcelulares, es más apropiado seleccionar loading control proteins específicos de las correspondientes orgánulas subcelulares, ya que esto garantiza mejor la precisión del loading control protein.
Localización de Expresión | Anticuerpo de Control de Carga Recomendado | Peso Molecular | Cat.No |
|---|---|---|---|
Proteínas Citoplasmáticas y Celulares | β-actina | 43 kDa | |
GAPDH | 36 kDa | ||
β-Tubulina | 55 kDa | ||
Proteínas Nucleares | PCNA | 29 kDa | |
Histona H3 | 17 kDa | ||
Proteínas de Membrana | ATP1A1 | 97–110 kDa | |
Lamin B | 67 kDa | ||
Proteínas Mitocondriales | COX IV | 17–20 kDa | |
VDAC1 | 31–37 kDa |
5. Seleccionar Proteínas de Control de Carga No Afectadas por Variables Experimentales
a. Al comparar niveles de expresión en múltiples muestras de tejido o células, GAPDH se prefiere como el loading control protein. Como proteína metabólica, GAPDH exhibe una expresión relativamente constante en tejidos vivos. En contraste, β-actina y β-Tubulina son proteínas estructurales, y la estructura celular varía a través de diferentes tejidos (lo que resulta en una expresión inconsistente de estas proteínas estructurales, haciéndolas inadecuadas para comparación intertejido/celular).
b. En algunas células, factores como hipoxia tisular y diabetes pueden llevar a un aumento en la expresión de GAPDH, haciéndola inadecuada como un loading control protein.
c. En experimentos relacionados con la proliferación celular, c-Jun no es adecuado para usarse como un loading control protein debido a su propia expresión fluctuante (su nivel de expresión cambia con el estado de proliferación celular).
d. Durante experimentos de apoptosis, proteínas como TBP y Lamin también son inadecuadas como loading control proteins (su expresión a menudo se ve alterada o regulada negativamente durante el proceso apoptótico).
e. Al trabajar con muestras inducidas o detectar anticuerpos modificados (por ejemplo, anticuerpos fosforilados), las proteínas estructurales como β-actina y β-Tubulina deben seleccionarse como loading control proteins. Su expresión es menos afectada por tratamientos de inducción o modificaciones postraduccionales, asegurando valores de referencia estables.
f. Al trabajar con diversas muestras de secreción (como plasma, leche, fluido intersticial, etc.), debido a la falta de estructuras celulares intactas, solo ciertas proteínas secretoras pueden seleccionarse como loading control proteins.
Métodos para Usar Anticuerpos de Control de Carga en Western Blotting
1. Para el interno de referencia etiquetado convenientemente: Añadir el anticuerpo de Control de Carga HRP-etiquetado durante el paso de incubación del anticuerpo secundario, y seguir el procedimiento experimental normal.
2. Para el convencional Control de Carga antibody: Cuando el peso molecular de la proteína objetivo no es significativamente diferente del de la seleccionada Control de Carga proteína, primero realizar incubación de anticuerpo, desarrollo de color y detección para la proteína objetivo. Luego, usar un Buffer Strip para lavar los anticuerpos en la membrana, y re-conducir incubación de anticuerpo, desarrollo de color y detección para el Control de Carga proteína.
3. Cuando existe una diferencia distintiva en peso molecular entre la proteína objetivo y la seleccionada Control de Carga proteína, puedes pre-tiñer la membrana después del transferencia de membrana. Basado en el peso molecular del Marcador de Proteínas, cortar la membrana en dos partes: una para proteínas de alto peso molecular y otra para proteínas de bajo peso molecular, a fin de separar la Control de Carga proteína de la proteína objetivo. Luego, incubar las dos piezas de membrana con el Control de Carga proteína anticuerpo y la proteína objetivo anticuerpo respectivamente.
 | Felicia Felicia es una especialista en soporte técnico en EnkiLife, con amplia experiencia profesional en desarrollo de anticuerpos, optimización y diseño y aplicación de ensayos ELISA. Se compromete a asistir a nuestros clientes al seleccionar productos adecuados de anticuerpos, optimizar protocolos experimentales de ELISA y resolver desafíos técnicos encontrados en el proceso, apoyando así el progreso fluido de sus proyectos de investigación de ciencias de la vida. |