Compartir literatura: Tinción fluorescente multiplexada de lesiones de tuberculosis pulmonar basada en TSA

Compartición de Literatura: Tinción Fluorescente Multiplexada de Lesiones Tuberculosas Pulmonares Basada en TSA

Antecedentes

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) es un patógeno humano obligado que entra en los alvéolos mediante transmisión por aerosol e induce la formación de lesiones primarias en macrófagos alveolares residentes y células mieloides reclutadas, las cuales luego se desarrollan en granulomas con características de necrosis central; este es el sello patológico típico de la tuberculosis. Mtb puede evadir la vigilancia inmune del huésped dentro de los granulomas y sobrevivir bajo entornos estresantes como hipoxia, pH bajo y privación nutricional. Por lo tanto, el análisis profundo de la estructura espacial de los tejidos lesionales, la distribución de subconjuntos de células inmunitarias y las características de colonización bacteriana es crucial para revelar la patogénesis de la tuberculosis y evaluar la efectividad de las medidas de intervención.

La investigación tradicional enfrenta dos principales cuellos de botella técnicos: primero, las técnicas convencionales de inmunofluorescencia tienen baja sensibilidad de señal y alto ruido de fondo, lo que dificulta la detección de antígenos de baja abundancia; segundo, durante el etiquetado multiplexado, la limitación de los anticuerpos de diferentes especies restringe el número de marcadores, y las secciones de tejido delgadas no pueden lograr una caracterización completa de las estructuras espaciales 3D. Además, el papel de las células estructurales de linajes epiteliales y mesenquimales pulmonares en la formación de microentornos susceptibles a Mtb no ha sido completamente elucidado, y existe una necesidad urgente de tecnología de imagen de alta sensibilidad que pueda preservar simultáneamente la integridad del tejido, señales fluorescentes reporteras endógenas y tinción nuclear. El protocolo optimizado establecido en el estudio de Lata S et al., titulado "Protocolo para imagen fluorescente multiplexada 3D de lesiones PTB utilizando tintas Opal-TSA para amplificación de señal," aborda precisamente las necesidades anteriores, logrando una detección precisa del etiquetado multiproteico en secciones de tejido grueso y reconstrucción 3D.

Métodos Principales

El principio central de la tecnología TSA es que los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano (HRP), en presencia de peróxido de hidrógeno, catalizan la conversión de tiramidas marcadas fluorescentemente en formas activas, las cuales luego se unen covalentemente a residuos de tirosina cerca de los antígenos objetivo, logrando una amplificación en cascada de señales. El estudio seleccionó tintas fluorescentes Opal como etiquetas, las cuales, comparado con anticuerpos secundarios fluorescentes tradicionales, mejoran significativamente la sensibilidad de señal y permiten imagen con potencia láser baja, reduciendo el fotoblanqueamiento del tejido.

El ciclo experimental es aproximadamente de 3 días. El flujo de trabajo principal implica el uso de ratones B6.Sst1S infectados con Mtb como modelo para obtener tejidos pulmonares mediante fijación por perfusión, seguido de incrustación en agar al 4% y microtomía por vibración, recuperación de antígenos mediante tratamiento inducido por calor o procesamiento con Triton X-100, bloqueo de sitios no específicos con peróxido de hidrógeno y diluyente de anticuerpos, luego completar múltiples etiquetados a través de ciclos de incubación de anticuerpo primario, incubación de anticuerpo secundario conjugado con HRP, incubación de tinta Opal, desprendimiento de anticuerpo y lavado, seguido de tinción nuclear. Finalmente, las imágenes se adquieren utilizando un microscopio de fluorescencia confocal con longitudes de onda de excitación y emisión que coinciden con las tintas Opal utilizadas para inmunotinción, y la reconstrucción 3D se completa utilizando el software Imaris 10.1.0.

Resultados Clave

1. Sensibilidad y Especificidad de Señal Mejoradas, Reducción del Ruido de Fondo

Comparado con las técnicas de inmunofluorescencia tradicionales que utilizan anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos, la sensibilidad de señal de la tecnología Opal-TSA se mejora significativamente. El panel izquierdo muestra resultados de imagen del antígeno de baja abundancia TTF1 etiquetado con Alexa Fluor 488 tradicional, mientras que el panel derecho muestra el mismo antígeno etiquetado con Opal 570. Ambos fueron capturados utilizando un objetivo de 10× con parámetros de exposición idénticos. De las imágenes, se puede observar claramente que el grupo de técnica tradicional a la izquierda solo captura fluorescencia débil y difusa y no puede localizar precisamente los sitios de expresión del antígeno; el grupo Opal-TSA a la derecha presenta señales fluorescentes brillantes y concentradas que pueden identificar con precisión los contornos de distribución de las células positivas para TTF1.

2. Habilitando Etiquetado Multiplexado con Anticuerpos de la Misma Especie, Superando Limitaciones de Cantidad de Etiquetado

Primero, nos enfocamos en la viabilidad del etiquetado dual con anticuerpos de la misma especie, utilizando secciones de tejido pulmonar de lesión PTB de 50μm de espesor como muestras, validadas a través del flujo de trabajo " Etiquetado - Desprendimiento - Re-etiquetado". Se utilizó un anticuerpo primario específico para iNOS derivado de conejo para la tinción, desarrollado con anticuerpo secundario conjugado con HRP y tinta Opal 690; después de desprender el complejo anticuerpo/anticuerpo secundario con buffer de desprendimiento BME/SDS suave, se añadió otro anticuerpo primario específico para TTF1 derivado de conejo, emparejado con anticuerpo secundario HRP y tinta Opal 570 para la tinción secundaria. Imágenes monocanal y fusionadas a baja y alta magnificación mostraron que las señales fluorescentes de iNOS y TTF1 tenían límites claros sin interferencia cruzada entre canales, probando que el protocolo de desprendimiento suave puede eliminar completamente los complejos de anticuerpos de la ronda anterior sin afectar las señales de tinta Opal ya unidas covalentemente, validando directamente la especificidad y fiabilidad del etiquetado dual con anticuerpos de la misma especie.

Expandimos ulteriormente al etiquetado triple y cuádruple, con todos los anticuerpos primarios derivados de conejo y objetivos distinguidos por tintas Opal de espectros diferentes. Las tres señales fluorescentes se localizaron en diferentes poblaciones celulares en el tejido lesional sin interferencia superpuesta; las cuatro señales correspondieron precisamente a las características de expresión de diferentes tipos celulares, con distribución del objetivo clara y distinguible en imágenes fusionadas. Ambos conjuntos de imágenes demostraron que este protocolo, a través de ciclos optimizados de desprendimiento y tinción, puede lograr un etiquetado multiplexado de al menos 4 anticuerpos de la misma especie, resolviendo el cuello de botella clave en las técnicas tradicionales donde "la fuente del anticuerpo limita la cantidad de etiquetado," proporcionando una herramienta eficiente para análisis de co-localización multiproteica en tejidos lesionales complejos.

Usando secciones de tejido pulmonar de lesión PTB de 50μm de espesor como muestras, presentamos una comparación entre imágenes confocales 2D e imágenes reconstruidas en 3D. A muestra imágenes planares 2D que solo pueden mostrar características de distribución del objetivo en un solo plano; B muestra imágenes 3D reconstruidas a partir de la secuencia Z-stack de esta sección utilizando el software Imaris 10.1.0, presentando intuitivamente la morfología tridimensional agrupada de células positivas para p63 en tejidos lesionales. A través de la comparación directa de los dos modos de imagen, se resaltan las ventajas de las secciones de tejido grueso combinadas con tecnología de reconstrucción 3D, mostrando que comparado con la imagen planar 2D, puede reflejar más comprensiva y tridimensionalmente la heterogeneidad espacial de los tejidos lesionales.

Lo anterior se centra en la compatibilidad de los sistemas de señal fluorescente endógena con la imagen inmunofluorescente multiplexada Opal-TSA. Utilizando tinción con anticuerpo anti-GFP, los resultados mostraron que las señales reporteras YFP endógenas co-localizaron completamente con las señales de tinción del anticuerpo, probando que el protocolo puede preservar la actividad de proteínas fluorescentes endógenas sin interferir con la detección del anticuerpo. La imagen fusionada del anticuerpo anti-TTF1 con señales reporteras bacterianas y señales YFP presentaba claramente las relaciones de distribución espacial de células inmunitarias, bacterias y células epiteliales pulmonares. Usando ratones B6.Sst1S sin genes reporteros IFN β-YFP como controles negativos, solo se detectaron señales duales fluorescentes bacterianas, sin fluorescencia YFP no específica, validando la especificidad de las señales endógenas.

Utilizando secciones de tejido pulmonar de lesión PTB de 50μm de espesor como muestras, con p63 como objetivos del anticuerpo de etiquetado, presentamos una comparación entre imágenes confocales 2D e imágenes reconstruidas en 3D. A muestra imágenes planares 2D que solo pueden mostrar características de distribución del objetivo en un solo plano; B muestra imágenes 3D reconstruidas a partir de la secuencia Z-stack de esta sección utilizando el software Imaris 10.1.0, presentando intuitivamente la morfología tridimensional agrupada de células positivas para p63 en tejidos lesionales. A través de la comparación directa de los dos modos de imagen, se resaltan las ventajas de las secciones de tejido grueso combinadas con tecnología de reconstrucción 3D, mostrando que comparado con la imagen planar 2D, puede reflejar más comprensiva y tridimensionalmente la heterogeneidad espacial de los tejidos lesionales.

3. Preservando Integridad del Tejido y Señales Endógenas, Soportando Análisis Estructural Espacial

Optimizado preparación y flujos de procesamiento de muestras pueden preservar completamente la integridad del tejido, señales reporteras fluorescentes endógenas y tinción nuclear, apoyando análisis estructural espacial.

Lo anterior se centra en la compatibilidad de los sistemas de señal fluorescente endógena con la imagen inmunofluorescente multiplexada Opal-TSA. Utilizando tinción con anticuerpo anti-GFP, los resultados mostraron que las señales reporteras YFP endógenas co-localizaron completamente con las señales de tinción del anticuerpo, probando que el protocolo puede preservar la actividad de proteínas fluorescentes endógenas sin interferir con la detección del anticuerpo. La imagen fusionada del anticuerpo anti-TTF1 con señales reporteras bacterianas y señales YFP presentaba claramente las relaciones de distribución espacial de células inmunitarias, bacterias y células epiteliales pulmonares. Usando ratones B6.Sst1S sin genes reporteros IFN β-YFP como controles negativos, solo se detectaron señales duales fluorescentes bacterianas, sin fluorescencia YFP no específica, validando la especificidad de las señales endógenas.

Utilizando secciones de tejido pulmonar de lesión PTB de 50μm de espesor como muestras, con p63 como objetivos del anticuerpo de etiquetado, presentamos una comparación entre imágenes confocales 2D e imágenes reconstruidas en 3D. A muestra imágenes planares 2D que solo pueden mostrar características de distribución del objetivo en un solo plano; B muestra imágenes 3D reconstruidas a partir de la secuencia Z-stack de esta sección utilizando el software Imaris 10.1.0, presentando intuitivamente la morfología tridimensional agrupada de células positivas para p63 en tejidos lesionales. A través de la comparación directa de los dos modos de imagen, se resaltan las ventajas de las secciones de tejido grueso combinadas con tecnología de reconstrucción 3D, mostrando que comparado con la imagen planar 2D, puede reflejar más comprensiva y tridimensionalmente la heterogeneidad espacial de los tejidos lesionales.

4. Método Alternativo a la Recuperación de Antígenos Inducida por Calor Tradicional

Utilizando secciones de tejido pulmonar de lesión PTB de 50μm de espesor como muestras, comparamos el protocolo de permeabilización celular de incubación con 2% Triton X-100 a temperatura ambiente durante 1 hora con la recuperación de antígenos inducida por calor tradicional (HIER, incubación con buffer Tris/borato/EDTA a 95°C durante 30 minutos). La validación mediante imagen de etiquetado único p63 a baja y alta magnificación, así como tinción dual Sox2 y Krt14, mostró que ambos protocolos lograron localización precisa del antígeno y detección específica. Además, el grupo Triton X-100 no solo se adapta al flujo de trabajo de etiquetado multiplexado sino que también evita los problemas de fragilidad tisular y encogimiento causados por altas temperaturas en HIER. Esto demuestra que el protocolo de permeabilización suave puede lograr efectos de detección comparables a la HIER tradicional mientras preserva mejor la integridad del tejido grueso, proporcionando una alternativa más práctica para la inmunotinción de secciones de tejido grueso.

Resumen

Este estudio optimizó sistemáticamente la tecnología Opal-TSA y estableció un protocolo de imagen fluorescente multiplexada 3D adecuado para secciones de tejido pulmonar grueso de ratones infectados con Mtb. Las ventajas principales incluyen alta sensibilidad de señal, capacidad de etiquetado multiplexado con anticuerpos de la misma especie, preservación de integridad del tejido y señales endógenas, y análisis estructural espacial claro. Este protocolo puede analizar con precisión las relaciones de distribución espacial entre células inmunitarias y células estructurales en lesiones PTB, así como el estado de supervivencia y replicación de Mtb en lesiones, proporcionando una herramienta técnica clave para elucidar el papel de las células estructurales pulmonares en la formación de microentornos susceptibles a Mtb y revelar los mecanismos moleculares del progreso de la tuberculosis. Además, la alta sensibilidad del protocolo permite un cribado rápido de regiones de interés, mejorando la eficiencia de la imagen de alta resolución subsiguiente y acelerando el descubrimiento de objetivos de intervención. Esta tecnología no solo resuelve el cuello de botella técnico clave en el análisis de lesiones PTB sino que proporciona una referencia importante para la caracterización espacial de tejidos en otras enfermedades.

Referencias

Lata S, Yabaji SM, O'Connell AK, Gertje HP, Kirber MT, Crossland NA, Kramnik I. Protocolo para imagen fluorescente multiplexada 3D de lesiones PTB utilizando tintas Opal-TSA para amplificación de señal. STAR Protoc. 21 Mar 2025;6(1):103640. doi: 10.1016/j.xpro.2025.103640. Epub 20 Feb 2025. PMID: 39982826; PMCID: PMC11889971.

Kits mIHC TSA Enkilife