TSA-mIF para el análisis TIME

TSA-mIF para Análisis de TIME

Antecedentes

La interacción entre el cáncer y el sistema inmune del huésped ocurre principalmente en el estroma tisular reactivo que rodea a los tumores, un área conocida como Microambiente Inmune Tumoral (TIME). El avance clínico de los inhibidores de puntos de control inmunitarios, particularmente terapias dirigidas contra la Proteína 1 de Muerte Programada (PD-1, un receptor coinhibidor de linfocitos T) y el Ligando 1 de Muerte Programada (PD-L1, también conocido como B7-H1/CD274), no solo ha impulsado la inmunoterapia contra el cáncer a una nueva era, sino que también ha convertido el análisis funcional del TIME en un enfoque central tanto en investigación como en entornos clínicos. La caracterización precisa de la composición celular, los estados funcionales y las redes de interacción molecular del TIME es un prerrequisito crucial para el cribado de biomarcadores predictivos de respuesta a inmunoterapia. Además, aclarar profundamente los mecanismos duales pro-cáncer/anti-cáncer de diversos tipos celulares inmunes en el TIME y sus asociaciones dinámicas con las células tumorales puede proporcionar apoyo central para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas inmunitarias. Sin embargo, la alta heterogeneidad del TIME y el desafío de detectar moléculas inmunes de baja abundancia plantean desafíos severos a las técnicas analíticas tradicionales, requiriendo urgentemente herramientas de detección in situ multiplexadas de alta sensibilidad para superar este dilema.

                                                                               Microambiente Tumoral (TME)^[1]

Ventajas

Durante más de un siglo, la tinción con hematoxilina-eosina (tinción HE) ha sido el método clásico para que los patólogos observen linfocitos, núcleos de células cancerígenas, glándulas y otras estructuras tisulares en muestras de biopsia y cirugía bajo examen microscópico. Sus características morfológicas proporcionan evidencia clave para la gradación y diagnóstico de enfermedades. La inmunohistoquímica (IHC) es un método rutinario para analizar marcadores clínicos como receptores de estrógeno y receptor del factor 2 de crecimiento epidérmico humano, pero ambos tienen limitaciones obvias en la investigación del TIME — la tinción HE no puede identificar con precisión subconjuntos celulares inmunes y moléculas funcionales, e IHC estándar solo puede detectar un marcador por sección, lo que dificulta capturar las características complejas de interacciones multicelulares y redes moleculares en el TIME. En años recientes, la tecnología de inmunofluorescencia multiplexada (mIF) basada en el principio de Amplificación de Señal con Tiaramida (TSA) ha superado completamente este dilema. A través de la estrategia central de "etiquetado con anticuerpo único - peroxidasa de rábano (HRP) catalizando unión covalente de moléculas de tiaramida conjugadas con fluoróforos a epítopos objetivo - elución de anticuerpos para múltiples rondas de tinción cíclica", combinada con microscopía de imagen multispectral y análisis de imágenes por IA, esta tecnología puede detectar simultáneamente 5-10 marcadores en una sola sección tisular. No solo permite identificar con precisión subconjuntos inmunes como células T CD8⁺, células reguladoras T y macrófagos asociados a tumores, sino que también permite preservar completamente la estructura tisular in situ, cuantificar las relaciones de proximidad espacial y patrones de interacción entre células. Resuelve el problema que las tecnologías tradicionales tienen dificultad para obtener simultáneamente información multidimensional de "tipificación celular - fenotipo funcional - distribución espacial", y proporciona soporte técnico fuerte para analizar los mecanismos inmunosupresores del TIME, cribado de biomarcadores de respuesta a inmunoterapia, y descubrimiento de regiones funcionales clave como estructuras linfoideas terciarias (TLS), convirtiéndose en una herramienta central para investigación de inmunopatología y transformación de diagnóstico y tratamiento precisos.

Casos

Utilizando tecnología de inmunofluorescencia multiplexada basada en TSA, Maltseva et al. analizaron sistemáticamente la composición celular inmune del TIME y las características de expresión de PD-1 en pacientes con grupos de respuesta e no respuesta a inmunoterapia. Este estudio logró identificación precisa y clasificación de células mediante software de análisis fenotípico inForm, asegurando objetividad y eficiencia en el análisis de datos. El experimento seleccionó un panel de anticuerpos dirigidos incluyendo CD8, PD-1, CD20, CD163 y FoxP3, apuntando respectivamente a linfocitos T citotóxicos, moléculas checkpoint inmunitarias, linfocitos B, macrófagos fenotípicos protumorales y células reguladoras T. Los núcleos fueron tincionados con DAPI y tratados con medio fijador anti-apagado de fluorescencia para mantener estabilidad de señal. Durante la fase de análisis cuantitativo, se seleccionaron 10 campos representativos bajo aumento de 200x, y se calculó el porcentaje de las células inmunes mencionadas en el estroma total dentro de nódulos tumorales (excluyendo el estroma circundante a células tumorales y estructuras linfoideas terciarias). A través del etiquetado multicolor (células CD8⁺ verdes, células CD20⁺ amarillas, células CD163⁺ rojas, células Treg naranjas, expresión PD-1 blanca, núcleos azules), el patrón de infiltración celular se presentó visualmente. Al mismo tiempo, software inForm fue utilizado para convertir datos de marcador único en mapas simulados de inmunohistoquímica para facilitar aún más la interpretación de resultados. A través de las ventajas de alta sensibilidad y detección multiplexada de tecnología TSA, este estudio reveló claramente las diferencias en el paisaje inmune del TIME entre pacientes con grupos diferentes de respuesta al tratamiento, proporcionando evidencia experimental directa para el cribado de biomarcadores de respuesta a inmunoterapia, y confirmando el valor de aplicación central de la tecnología de inmunofluorescencia multiplexada TSA en el análisis profundo del TIME en muestras clínicas.

Figura 1 Infiltración tumoral de linfocitos citotóxicos CD8, linfocitos B CD20, células T reguladoras FoxP3 y macrófagos CD163 en respondedores (A) y no respondedores (B)^[2].

En un estudio del microambiente inmune tumoral en carcinoma de células no pequeñas (CCNP), Peng et al. analizaron sistemáticamente las características de expresión y relaciones de interacción de 10 marcadores inmunes dentro de nidos tumorales (TN) y estroma tumoral (TS) utilizando tecnología de inmunofluorescencia multiplexada. Los resultados mostraron múltiples interacciones celulares inmunes fuertemente correlacionadas dentro del TIME: células B CD20⁺ estromales con células T CD4⁺CD38⁺, neutrófilos con células FOXP3⁺, neutrófilos estromales con células T reguladoras intratumorales, células T CD38⁺ intratumorales con macrófagos M2 intra-tumorales que expresan PD-L1, y células CD8⁺ intratumorales con macrófagos M2 intra-tumorales que expresan PD-L1. Además, el estudio encontró correlaciones moderadas entre células CD133⁺ intra-tumorales y macrófagos M1 intra-tumorales, particularmente macrófagos M1 que no expresan PD-L1. Esto sugiere que los macrófagos intra-tumorales pueden desempeñar un papel mediando respuestas inmunes de tipo agotamiento de células T CD8⁺. A través de las ventajas de detección multiplexada de tecnología inmunofluorescencia multiplexada, este estudio delineó claramente el paisaje inmune del TIME y la red de interacción celular del CCNP, proporcionando referencias importantes para exploración posterior de mecanismos y cribado de dianas terapéuticas.

Figura 2 Perfiles de expresión de 10 marcadores inmunes en carcinoma de células no pequeñas. La figura muestra imágenes individuales y fusionadas de inmunofluorescencia, así como secciones patológicas^[3].

En un estudio de microarreglos tisulares (TMA), Mori et al. tincionaron muestras TMA de tumores de vía aérea bronquial y cáncer de mama utilizando protocolos optimizados de inmunofluorescencia multiplexada (IP1 e IP2). Desmezclado y análisis de imágenes multispectrales se completaron usando software inForm, mientras generaba "vistas patológicas" simulando tinción DAB para asistir en interpretación de resultados. Entre ellos, el protocolo IP1 puede identificar simultáneamente 5 tipos celulares en el TME (células T CD3⁺, células B CD20⁺, células T reguladoras CD3⁺FOXP3⁺, mastocitos CD117⁺CK⁻, células epiteliales/tumorales CK⁺). Combinado con tinción de Ki67, el estado de proliferación celular puede ser evaluado, y diferentes subconjuntos celulares pueden diferenciarse mediante co-localización de CD117 y CK. El protocolo IP2 se centra en 4 tipos celulares clave (células T CD3⁺CD8⁻, células T citotóxicas CD3⁺CD8⁺, macrófagos CD68⁺, células epiteliales/tumorales CK⁺) e incorpora detección de moléculas checkpoint inmunitarias PD-1/PD-L1, capturando exitosamente las características de co-localización de macrófagos CD68⁺PD-L1⁺ y células T PD-1⁺ en muestras de cáncer de mama. A través de la combinación de protocolos estandarizados de mIF y tecnología TMA, este estudio logró eficientemente el análisis sistemático de composición celular del TME, estado funcional e interacciones de moléculas inmunes en múltiples tipos de muestras tumorales, proporcionando una vía factible para investigación clínica de alto rendimiento del TIME.

Figura 3  Microarreglos tisulares de biopsia bronquial humana tincionados utilizando dos protocolos de inmunofluorescencia multiplexada, IP1 (a) e IP2 (b)^[4].

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Para más detalles, por favor consulte Kit TSA mIHC

Referencias

1. Rojas F, Hernandez S, Lazcano R, Laberiano-Fernandez C, Parra ER. Inmunofluorescencia Multiplex y el Flujo de Trabajo de Análisis de Imagen Digital para Evaluación del Microambiente Inmune Tumoral en Investigación Traducional. Front Oncol. 2022 Jun 27;12:889886. doi: 10.3389/fonc.2022.889886. PMID: 35832550; PMCID: PMC9271766.

2. Maltseva A, Kalinchuk A, Chernorubashkina N, Sisakyan V, Lots I, Gofman A, Anzhiganova Y, Martynova E, Zukov R, Aleksandrova E, Kolomiets L, Tashireva L. Predicción de Respuesta a Inmunoterapia Dirigida en Cáncer de Endometrio a través del Microambiente Inmune Tumoral: Un Estudio Multicéntrico y Observacional. Int J Mol Sci. 2024 Abr 1;25(7):3933. doi: 10.3390/ijms25073933. PMID: 38612743; PMCID: PMC11011874.

3. Peng H, Wu X, Zhong R, Yu T, Cai X, Liu J, Wen Y, Ao Y, Chen J, Li Y, He M, Li C, Zheng H, Chen Y, Pan Z, He J, Liang W. Perfilado del Microambiente Inmune Tumoral de Carcinoma de Células No Pequeñas de Pulmón Utilizando Inmunofluorescencia Multiplexada. Front Immunol. 2021 Nov 4;12:750046. doi: 10.3389/fimmu.2021.750046. PMID: 34804034; PMCID: PMC8600321.

4. Mori H, Bolen J, Schuetter L, Massion P, Hoyt CC, VandenBerg S, Esserman L, Borowsky AD, Campbell MJ. Caracterización del Microambiente Inmune Tumoral con Inmunofluorescencia Multiplexada Basada en Tiaramida. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2020 Dic;25(4):417-432. doi: 10.1007/s10911-021-09479-2. Epub 2021 Feb 15. PMID: 33590360; PMCID: PMC7960613.