Experimento mIHC-TSA: Puntos técnicos clave y preguntas frecuentes típicas

Experimento mIHC-TSA: Puntos Técnicos Clave y Preguntas Frecuentes

I. Puntos Técnicos Clave

1. Recuperación de Antígeno: La recuperación de antígenos típicamente utiliza ácido cítrico 1× (pH 6.0) como solución de recuperación, con recuperación a alta temperatura y alta presión. Coloque las secciones en una olla de presión, agregue la cantidad adecuada de solución de recuperación, cierre la olla de presión y espere 2 minutos después de que aparezca el vapor. Enfríe a temperatura ambiente para completar la recuperación. [Para objetivos con expresión débil, se puede utilizar EDTA (pH 9.0) como solución de recuperación. Para tejidos propensos al desprendimiento, como tejido óseo o cerebral, se recomienda la recuperación por microondas, controlando la temperatura de recuperación alrededor de 80℃, y se puede utilizar ácido cítrico 2× (pH 6.0) como solución de recuperación.]

2. Bloqueo de Enzimas Endógenas: Prepare una solución del 3% de H2O2 con agua pura, coloque las secciones en la solución y incube a temperatura ambiente durante 20 minutos. Para tejidos propensos al desprendimiento, reduzca apropiadamente el tiempo de incubación de H2O2. 

3. Selección y Dilución de Anticuerpos: Priorice el uso de anticuerpos monoclonales y evite los anticuerpos policlonales. Para muestras de ratón, intente evitar elegir anticuerpos primarios derivados de ratón. Si se seleccionan anticuerpos primarios de ratón, el anticuerpo secundario se unirá no solo al anticuerpo primario sino también a la IgG endógena en el tejido, resultando en tinción inespecífica. La proporción de dilución del anticuerpo primario necesita ser determinada mediante experimentos preliminares. Una concentración excesivamente alta puede llevar a una unión inespecífica, mientras que una concentración excesivamente baja puede resultar en señales débiles. Se recomienda establecer gradientes de concentración para cribar las condiciones óptimas.

4. Especificaciones del Uso de Tintes TSA: Los tintes TSA son sustancias fotosensibles y las soluciones de trabajo necesitan ser preparadas recién. Para objetivos de baja expresión, elija tintes con alta intensidad fluorescente y fuertes propiedades anti-desvanecimiento (como Cy5, AF594) para aumentar la tasa de detección utilizando el efecto de amplificación de señal TSA. Para objetivos de alta expresión, elija tintes con intensidad fluorescente moderada (como FITC, Cy3) para evitar la saturación de señales que enmascaren detalles.

5. Evite el Solapamiento Espectral: Seleccione combinaciones de tintes con longitudes de onda de emisión espaciadas ≥50nm aparte, por ejemplo: DAPI (461nm) + AF488 (519nm) + Cy3 (570nm) + Cy5 (670nm), lo cual puede reducir efectivamente el cross-talk. Evite usar FITC (520nm) y AF488 (519nm), o Cy3 (570nm) y AF594 (617nm) simultáneamente.

6. Compatibilidad con Equipos de Imagen: Para TSA fluorescente, es necesario confirmar si los canales fluorescentes son compatibles con las longitudes de onda del microscopio del laboratorio. Para microscopios de fluorescencia ordinarios, se pueden usar tanto microscopios confocales como microscopios multiespectrales. Antes del experimento, se requiere determinar el número de canales/filtros de su propio instrumento, y debe priorizarse tintes fluorescentes que coincidan con los filtros del instrumento.

7. Eficiencia de Elución de Anticuerpos: Si algunos anticuerpos tienen alto titer y alta afinidad y no se eluyen completamente fácilmente, se puede aumentar el número de pasos de elución, y debe prestarse atención a mantener las secciones planas durante la operación. Para muestras propensas al desprendimiento de sección, la temperatura del eluyente puede bajarse o el tiempo de incubación puede acortarse.

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II. Preguntas Frecuentes Comunes

1. ¿Se pueden usar secciones flotantes congeladas para experimentos TSA?

Respuesta: El kit TSA no es adecuado para secciones flotantes. Porque las secciones flotantes son demasiado gruesas, lo cual no es propicio para la penetración de reactivos. Las secciones flotantes pueden cambiar de forma durante la tinción, como enroscarse o arrugarse.

2. ¿Cómo elegir anticuerpos para secciones de parafina mIHC?

Respuesta: Intente usar anticuerpos monoclonales, con aplicaciones de anticuerpos seleccionadas como IHC/mIHC/IHC-P, y priorice los anticuerpos que han sido verificados mediante experimentos de knockout.

3. ¿Por qué ocurre la unión inespecífica?

Respuesta: a. Si se usan anticuerpos policlonales, están propensos a la unión inespecífica, lo cual puede mejorarse cambiando a anticuerpos monoclonales o reduciendo la concentración e intensidad de recuperación. b. Si la amplificación de señal es demasiado fuerte, reduzca el tiempo de reacción del tinte o la concentración. c. Si la concentración del anticuerpo primario es demasiado alta o la recuperación de antígeno es excesiva, use una proporción de dilución de anticuerpo más baja o reduzca la intensidad de recuperación de antígeno.

4. ¿Cómo evitar el desprendimiento de secciones?

Respuesta: a. Si los portaobjetos no han sido tratados con anti-desprendimiento, use portaobjetos anti-desprendimiento o trate los portaobjetos con anti-desprendimiento. b. Si la fijación del tejido es incompleta o la deshidratación es insuficiente, re-optimize los métodos de pretratamiento de la muestra, como extender el tiempo de fijación y deshidratación. c. Si se aplica una recuperación térmica de antígeno excesiva, use una suave recuperación por microondas con temperatura controlada alrededor de 80℃ o inferior, y se puede utilizar ácido cítrico 2× (pH 6.0) como solución de recuperación. d. Si la temperatura de la solución eluyente es demasiado alta, reduzca la temperatura de la solución eluyente o acorte el tiempo de incubación.

5. ¿Por qué ocurre el cross-talk?

Respuesta: a. Puede estar relacionado con el ancho de banda del filtro del equipo de imagen; intente usar filtros con ancho de banda de longitud de onda estrecho. b. Puede estar relacionado con la elución incompleta de los anticuerpos del turno anterior; para anticuerpos con alta afinidad como CK, extienda las condiciones de elución de anticuerpo (aumente temperatura y tiempo de elución, etc.). c. Puede estar relacionado con desequilibrio de señal, tal como tintes de canal adyacente donde uno es demasiado fuerte y el otro demasiado débil, causando desbordamiento de la señal fuerte. d. Otras razones posibles incluyen mezclar anticuerpos, olvidar eluir/recuperar en el turno siguiente, etc.

6. Para muestras de ratón, ¿se pueden seleccionar anticuerpos derivados de ratón?

Respuesta: Este método generalmente no se recomienda, porque si el anticuerpo primario es derivado de ratón, el anticuerpo secundario también necesita ser anti-ratón, lo cual puede reaccionar cruzadamente con la IgG presente en la muestra misma, llevando a unión inespecífica. Si es necesario usar un anticuerpo primario de la misma especie que la muestra, se recomienda realizar un experimento de control negativo añadiendo solo el anticuerpo secundario sin el anticuerpo primario para detectar si se generan señales inespecíficas.

7. ¿Cómo elegir el orden de marcadores/anticuerpos para tinción multiplex?

Respuesta: Coloque los anticuerpos que son difíciles de eluir en el último turno para evitar cross-talk. Alternar entre anticuerpos primarios de conejo y ratón. Coloque marcadores que son difíciles de detectar en turnos anteriores. Para objetivos de baja expresión, elija tintes con alta intensidad fluorescente y fuertes propiedades anti-desvanecimiento y colóquelos en los turnos anteriores. Para objetivos de alta expresión, elija tintes con intensidad fluorescente moderada para evitar la saturación de señales que enmascaren detalles. Si dos proteínas están co-expresadas, se recomienda elegir tintes con grandes diferencias de longitud de onda.

8. ¿Es necesario evitar la luz durante la operación experimental? ¿Cuánto tiempo pueden almacenarse las secciones tincadas?

Respuesta: Los tintes fluorescentes del Kit TSA Enklife exhiben un excelente rendimiento anti-desvanecimiento, por lo que no hay necesidad de operaciones deliberadas de blindaje de luz. Sin embargo, debe evitarse la exposición directa a la luz solar y una exposición prolongada durante el uso. Las secciones tincadas generalmente pueden almacenarse a 4°C durante 6 a 12 meses.

Kits mIHC TSA Enklife