Compartir literatura: Análisis de inmunofluorescencia múltiple del cáncer de mama triple negativo temprano

Compartición de Literatura: Análisis de Inmunofluorescencia Multiplex en Carcinoma de Mama Triples Negativo Temprano

Antecedentes

El carcinoma de mama triple negativo (TNBC) es el subtipo más agresivo del cáncer de mama, con un pronóstico muy pobre y opciones limitadas de tratamiento para pacientes avanzados. En comparación con otros subtipos de cáncer de mama, el TNBC presenta una inmunogenicidad más alta, con una gran enriquecimiento de linfocitos infiltrantes tumorales (LIT) y niveles altos de expresión de PD-L1, lo que lo convierte en un grupo población potencialmente adecuado para la inmunoterapia. Estudios anteriores han confirmado que los linfocitos infiltrantes del estroma tumoral (sTILs) tienen valor predictivo pronóstico en el TNBC y pueden predecir la eficacia de la quimioterapia neoadyuvante y adyuvante, pero actualmente los LIT no se han incorporado a los sistemas de evaluación clínica rutinarios. El ensayo clínico aleatorizado IBCSG 22-00 es un ensayo fase III diseñado para evaluar la eficacia del mantenimiento con dosis bajas de ciclofosfamida-metotrexato (CM) en pacientes con cáncer de mama receptor negativo al hormona tras quimioterapia adyuvante estándar. Estudios anteriores encontraron que el tratamiento de mantenimiento con CM no tuvo un efecto estadísticamente significativo en la reducción del riesgo de recaída en pacientes con TNBC, pero los pacientes con niveles altos de sTILs (>500) mostraron una reducción más pronunciada del riesgo de recaída de cáncer de mama tras recibir tratamiento de mantenimiento con CM. En base a esto, Rusakiewicz S et al. caracterizaron las características de infiltración celular inmune en pacientes con TNBC mediante tecnología de tinción de inmunofluorescencia de 6 colores, evaluaron el valor pronóstico de subconjuntos específicos de células inmunes y su papel predictivo en la eficacia del tratamiento de mantenimiento con CM, mientras analizaban el impacto de las características espaciales de distribución celular inmune sobre la eficacia del tratamiento y el pronóstico del paciente, proporcionando evidencia para el desarrollo de estrategias de tratamiento personalizado para pacientes con TNBC.

Métodos de Investigación

La cohorte del estudio se derivó de la población de intención de tratar del ensayo IBCSG 22-00, con confirmación del estado TNBC a través de revisión patológica central, y poseía secciones de tejido fijadas en formalina e incrustadas en parafina (FFPE) y resultados de detección de LIT. Las secciones FFPE sometieron tinción HE y tinción de inmunofluorescencia multiplex (mIF). Las secciones teñidas con HE fueron revisadas por patólogos para confirmar el contenido tumoral del tejido y delinear regiones de interés. La tinción mIF se realizó después de desparafinado, recuperación de epítopos y bloqueo de peroxidasa endógena, seguido de incubación secuencial con anticuerpos primarios contra CD4, FOXP3, CD3, citokeratina, CD8, anticuerpos secundarios marcados con HRP y fluoróforos específicos, y finalmente se teñió con Spectral DAPI para tinción nuclear y montaje, almacenado a 4°C en la oscuridad y obtenido imágenes multiplex IF dentro de las 48h usando un sistema de imagen Vectra 3.0. Se recopilaron bibliotecas espectrales específicas del tejido y específicas de canal para cada fluoróforo en cada canal y autofluorescencia de tejido tumoral para lograr una separación óptima de señales inmunofluorescentes y análisis multiplex. Después de pre-escanear secciones teñidas con inmunofluorescencia con objetivo 10×, el software Phenochart™ de observación completa de sección se utilizó para anotar regiones de interés que contienen islotes tumorales y estroma, seguido de adquisición multispectral de imagen de alta resolución con objetivo 20×. Usando software inForm 2.3.0, las regiones tumorales y estromales se distinguieron basándose en la tinción de citokeratina, el segmentación celular se realizó usando tinción DAPI, y subconjuntos celulares inmunes fueron cuantificados mediante algoritmos de fenotipo de aprendizaje activo, con datos de población celular finalmente exportados y procesados usando scripts R auto-desarrollados. Además, basándose en el estado de infiltración de células CD3⁺ en estroma y epitelio, los tumores se clasificaron en categorías tipo inflamado (células CD3⁺ infiltrando tanto estroma como tumor), tipo excluido (células CD3⁺ infiltrando principalmente estroma) y tumor frío (infiltración de células CD3⁺ muy baja).

Asociación de Infiltración Celular Inmune con Pronóstico del Paciente

Se realizó detección de inmunofluorescencia multiplex en secciones de tejido tumoral de 204 pacientes para observar la infiltración celular inmune en los tumores. El experimento marcó simultáneamente 6 marcadores clave: usando CK para localizar células cancerígenas, usando CD3, CD4, CD8 para marcar diferentes tipos de células T, usando FoxP3 para marcar células T reguladoras con funciones inmunosupresoras, y finalmente usando DAPI para marcar núcleos de todas las células. Las imágenes muestran claramente los efectos de tinción individual de cada marcador, correspondientes imágenes bright-field del tejido, y resultados de tinción combinada. Desde los resultados de detección de este caso, se encontró que aunque la muestra tumoral tenía abundante infiltración inmune, no hubo infiltración celular inmune en el área de nido celular positivo para CK.

Se utilizó análisis de componentes principales para el análisis multivariante de todos los datos de infiltración celular inmune. Los resultados mostraron que el primer componente principal podía explicar el 73% de la variación en todos los marcadores detectados, indicando que esta dimensión podría resumir bien las características de infiltración inmune del tumor. Desde los datos generales de pacientes, más células inmunes en el tejido tumoral significaba menor riesgo del paciente de recurrencia a distancia y mayor tiempo libre de recurrencia a distancia. Esta tendencia fue particularmente evidente en pacientes con metástasis linfática. Sin embargo, también hubo un hallazgo contrario: para pacientes sin metástasis linfáticas y con muy pocas células inmunes en el tumor, su pronóstico parecía mejorar después del tratamiento de mantenimiento con CM, con reducción del riesgo de recaída. Pero este resultado aún necesita validación con más datos de pacientes para confirmar su fiabilidad.

Asociación de Infiltración Celular Inmune con CM Eficacia del Tratamiento de Mantenimiento

Para clarificar el impacto de la infiltración inmune en el intervalo libre de recurrencia a distancia del paciente (DRFI), el estudio realizó análisis univariados sobre los efectos de CD3, CD4, CD8 y otros subconjuntos de células T, linfocitos infiltrantes del estroma tumoral, y linfocitos infiltrantes intraepiteliales tumorales. Niveles altos de linfocitos infiltrantes del estroma tumoral se asociaron con mejor DRFI, particularmente en pacientes LN ⁺ . Entre estos, el efecto de las células infiltrantes del estroma CD3⁺ fue más prominente en el grupo que no recibió tratamiento CM, y la interacción estadísticamente significativa entre variables dicotómicas de este marcador y grupos de tratamiento indicó que el tratamiento CM podría mejorar el DRFI en la población general con niveles bajos de linfocitos infiltrantes del estroma tumoral y pacientes sin metástasis linfáticas. Niveles altos de linfocitos infiltrantes intraepiteliales tumorales en tejido tumoral tuvieron efectos de mejora más débiles sobre el DRFI, y solo fueron evidentes en pacientes con metástasis linfáticas positivas para tumores, mientras que para pacientes con enfermedad linfática positiva y bajos niveles de CD3⁺ intraepiteliales infiltrantes tumorales, el tratamiento de mantenimiento CM podría tener efectos adversos.

El estudio combinó aún más regímenes de tratamiento y niveles de infiltración de linfocitos T reguladores estromales e intraepiteliales para evaluar el DRFI del paciente, con resultados relacionados mostrados anteriormente. En pacientes positivos para linfáticos, tanto niveles altos de células T reguladoras estromales como niveles altos de células T reguladoras intraepiteliales se asociaron con DRFI más largos, mientras que pacientes con bajos niveles de células T reguladoras estromales o intraepiteliales podrían experimentar efectos adversos del tratamiento de mantenimiento CM.

Impacto de la Distribución Espacial Celular Inmune

Finalmente, el estudio evaluó las características de distribución espacial celular inmune en 204 muestras de carcinoma de mama triple negativo y clasificó las muestras basándose en el estado de infiltración de células T CD3⁺ estromales y células T CD3⁺ intraepiteliales. Se visualizaron primero las regiones tumorales seleccionadas, con la Figura B mostrando ejemplos típicos de casos tumorales inmunoinflamados, inmunosexcluidos e inmunocold simples, mientras que la Figura C muestra la distribución de tipos excluidos versus inflamados CD3 entre 203 muestras de carcinoma de mama triple negativo. El análisis DRFI basado en esta clasificación mostró que el tratamiento de mantenimiento con CM podría tener efectos adversos sobre las muestras positivas para linfáticos excluidas por células T.

Conclusión

En este estudio sobre carcinoma de mama triple negativo, la tecnología de inmunofluorescencia multiplex es la técnica central para analizar el microambiente inmune tumoral y extraer las asociaciones entre la infiltración inmune y el pronóstico así como la eficacia del tratamiento. A través de la tinción combinada de 6 marcadores, identifica y cuantifica con precisión CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺ células T y células T reguladoras, clarifica las ubicaciones de infiltración de estas células inmunes en el estroma tumoral y epitelio, y distingue linfocitos infiltrantes tumorales estromales/intraepiteliales, proporcionando datos fundamentales para la fenotipificación inmune. Además, los datos inmunitarios obtenidos pueden revelar asociaciones entre alta infiltración de células T CD3⁺ y células T reguladoras con DRFI, aclarar el impacto de diferentes características inmunes sobre la eficacia del tratamiento CM, y proporcionar evidencia fenotípica inmune para el cribado de poblaciones elegibles para tratamiento. Además, esta tecnología puede visualizar la distribución espacial celular inmune a través de imagen multispectral, clasificando exitosamente las muestras TNBC en tipos tumorales inflamados, excluidos y fríos, proporcionando soporte técnico para la estratificación clínica. También puede coordinarse con tinción HE para verificar el contenido del tejido, combinar herramientas automatizadas para lograr una cuantificación precisa de células individuales, evitar limitaciones de marcadores únicos, y proporcionar datos de alta calidad para análisis estadístico.

Referencias

Rusakiewicz S, Tyekucheva S, Tissot-Renaud S, Chaba K, Imbimbo M, Benedetti F, Kammler R, Hornfeld J, Munzone E, Gianni L, Thurlimann B, Láng I, Pruneri G, Gray KP, Regan MR, Loi S, Colleoni M, Viale G, Kandalaft L, Coukos G, Curigliano G. Imagen inmunocelular multiplexada de alto rendimiento en pacientes con cáncer de mama triple negativo temprano de alto riesgo: Análisis del Ensayo del Grupo Internacional de Estudios sobre Cáncer de Mama (IBCSG) 22-00. Eur J Cancer. 2024 Mar; 200:113535. doi: 10.1016/j.ejca.2024.113535. Epub 2024 Jan 24. PMID: 38309015.

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