Tecnología de preparación de anticuerpos monoclonales
Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos producidos por el clonaje de un solo linfocito B y reconocen un único epítopo antigénico, caracterizados por alta especificidad, alta uniformidad y producción en masa.
La tecnología de preparación de anticuerpos monoclonales es una tecnología clave en el campo de la biología y la medicina, pionera en 1975 por el biólogo alemán Georges Jean Franz Köhler y el biólogo argentino/británico César Milstein, por lo que recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina. Mediante la fusión de linfocitos B con células mieloma para formar células hibrídas, se seleccionan líneas celulares con capacidad de secreción de anticuerpos y características de proliferación ilimitada utilizando medio de selección HAT, logrando así la producción a gran escala de anticuerpos únicos. Esta es la técnica de hibridoma tradicional que es ampliamente conocida por el público y que sigue utilizándose hasta el día de hoy. Los anticuerpos monoclonales han atravesado cuatro etapas: anticuerpos murinos, anticuerpos quiméricos humano-murino, anticuerpos humanizados y anticuerpos totalmente humanos. La tecnología de producción de anticuerpos monoclonal correspondiente ha experimentado un desarrollo y mejora continua desde el pionaje de la tecnología de hibridoma hasta la tecnología de displays de fagos, tecnología de animales transgénicos y tecnología de linfocitos B individuales.
Los anticuerpos monoclonales originales se generaron utilizando proteínas derivadas de ratón, pero no fueron tolerados en humanos con uso a largo plazo. Para superar la inmunogenicidad de los anticuerpos monoclonales murinos y optimizar sus efectos biológicos en humanos, los científicos desarrollaron posteriormente anticuerpos quiméricos humano-murino. A través de tecnología de ingeniería genética, la región variable de los anticuerpos de ratón se fusiona con la región constante de los anticuerpos humanos, y solo se conserva el sitio de unión al antígeno derivado del ratón en la estructura, mientras que el resto es reemplazado por secuencias de anticuerpos humanos, lo cual mejora considerablemente su tolerancia y eficacia en humanos. Con el avance continuo de la tecnología, los científicos han desarrollado con éxito anticuerpos humanizados totalmente a través de la tecnología de display de fagos y la tecnología de ratones transgénicos, mejorando aún más la eficiencia y escala de producción de anticuerpos humanos, e innovación que ha impulsado la aplicación clínica y el crecimiento del mercado de anticuerpos monoclonales.
1、Tecnología de hibridoma
El principio básico es aprovechar el hecho de que los linfocitos B pueden producir un solo anticuerpo específico pero no pueden proliferar infinitamente in vitro, mientras que las células mieloma pueden proliferar infinitamente in vitro pero no producen anticuerpos. Las células tienen las ventajas de ambas, y se pueden obtener a través del cribado y cultivo numerosas líneas celulares hibrídas que producen anticuerpos monoespecíficos, y luego preparar los anticuerpos monoclonales. Como piedra angular, la tecnología de hibridoma logró por primera vez la producción a gran escala de anticuerpos monoclonales, y aunque existen limitaciones como el origen murino, eficiencia de producción y estabilidad de la línea celular, su tecnología madura, operación relativamente sencilla y bajo costo siguen siendo comúnmente utilizadas en laboratorios e industrias.
2、Tecnología de display de fagos
El principio de la tecnología de display de fagos es insertar los fragmentos de genes codificantes de proteínas y péptidos exógenos en la posición adecuada de la secuencia genética que codifica la proteína del caparazón bacteriófago a través de la tecnología de ingeniería genética. La proteína o péptido extraño se fusiona con la proteína del caparazón del fago formando una proteína fusión, que se expresa en la superficie del fago con el reensamblaje de los progenitores del fago. Las proteínas fusión mantienen estructura espacial independiente y actividad biológica, y pueden reconocer y unirse a moléculas objetivo. Los pasos básicos para preparar anticuerpos monoclonales utilizando técnicas de display de fagos incluyen: (1) Crear una biblioteca de fagos que contenga secuencias de ADN de anticuerpos y evaluar la diversidad clonal de la biblioteca. (2) El antígeno diana purificado se utilizó para cribar los fagos unidos inespecíficamente mediante cribado y selección. (3) Se seleccionan fagos monoclonales, se detecta especificidad por ELISA e identifican clones positivos mediante secuenciación. (4) Subclonar el gen de anticuerpo positivo en el vector de expresión, transfectar la célula huésped para inducir expresión, y luego purificar el anticuerpo mediante cromatografía de afinidad y otros métodos, verificando su actividad mediante experimentos. Las dos partes clave son la construcción de bibliotecas de fagos de anticuerpos y el cribado de anticuerpos.
3、Tecnología de animales GMO
Los anticuerpos preparados a partir de ratones ordinarios son "derivados de ratón". Cuando se inyectan en el cuerpo, el sistema inmunológico del cuerpo los reconoce como una sustancia extraña y ataca, causando que la droga de anticuerpo falle y potencialmente cause efectos secundarios graves. Aunque este rechazo puede mitigarse a través de "modificación humanizada", el proceso es complejo y aún puede retener algunas características del origen de rata. Los científicos luego desarrollaron un anticuerpo quimérico humano-murino. A través de la ingeniería genética, los genes endógenos responsables de codificar las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos en animales se inactivan o se eliminan directamente. Se importan clústeres de genes de anticuerpos sin reordenar desde humanos al genoma del ratón. De esta manera, las células B de los animales completan una serie de procesos inmunológicos complejos como el reordenamiento V(D)J de los genes Ig humanos en el cuerpo, resultando en la producción de "totalmente humanos" o anticuerpos altamente humanizados. Una vez que se disponen de estos ratones transgénicos, los anticuerpos monoclonales totalmente humanos pueden prepararse utilizando tecnología de hibridoma tradicional o tecnología de linfocitos B individuales.
4、Tecnología de linfocito B único
La tecnología de linfocito B único omite la fusión celular en las técnicas tradicionales de hibridoma y apunta directamente a un solo linfocito B específico para un antígeno. Utilizando citometría de flujo, chips de microfluídica y otras tecnologías, los linfocitos B individuales que pueden unirse específicamente a antígenos objetivo se criban e aíslan con precisión de la sangre periférica, bazo y otros tejidos inmunizados en animales o cuerpos inmunes. Ya sea mediante el amplificación directa de los genes de región variable VH (cadena pesada) y VL (cadena ligera) de sus anticuerpos por RT-PCR, o mediante cultivo individual de linfocitos B in sistemas de cultivo in vitro para secretar anticuerpos y luego clonar los genes del anticuerpo. Los genes amplificados de anticuerpos se insertan en vectores de expresión adecuados, transfectan células huésped para expresión y purificación, y finalmente se obtienen anticuerpos monoclonales con capacidad de unión específica.
Estas nuevas tecnologías tienen sus propias ventajas y desempeñan un papel importante en diferentes escenarios de aplicación, promoviendo conjuntamente el progreso y desarrollo de la tecnología de anticuerpos monoclonales y trayendo cambios revolucionarios al campo de las biomedicina. Hoy, los anticuerpos monoclonales humanos son la categoría que más rápido crece de terapias con anticuerpos monoclonales que entran en ensayos clínicos. Visita nuestro sitio web para encontrar el anticuerpo perfecto para tu objetivo.
Comparación de las Cuatro Tecnologías
Enfoque tecnológico | Período de tiempo | Fuente del anticuerpo | Características |
|---|---|---|---|
Tecnología de hibridoma | 3-6 meses | Rata/Conejo | Tecnología madura y bajos costos de I+D. Sin embargo, toma mucho tiempo y tiene ciertas limitaciones, y no es posible preparar anticuerpos sin inmunidad y con antígenos altamente tóxicos. La tasa de fusión celular del hibridoma es baja, la producción es inestable, y se requiere transformación humanizada. |
Tecnología de display de fagos | 2-3 meses | Humano/Ratón | Tiempo corto y plan de diseño flexible. Los anticuerpos pueden prepararse sin inmunidad y con antígenos altamente tóxicos. Sin embargo, las cadenas pesadas y ligeras no se emparejan naturalmente, y la forma del anticuerpo es principalmente Fab o scFV, lo cual está limitado por la capacidad de biblioteca de los fagos exhibidos. |
Tecnología animal GMO | 6-12 meses | Ratón Humanizado/Ratas | Puede generar directamente anticuerpos totalmente humanos, su actividad está bien adaptada al entorno fisiológico humano, puede ser herencia estable, y puede establecer razas animales a largo plazo. La tecnología es extremadamente difícil, requiriendo edición genética y cría animal, con ciclos largos, altos costos y baja eficiencia de edición genética. |
Tecnología de linfocito B único | 1-2 meses | Humano/Ratón | Toma la menor cantidad de tiempo para capturar directamente linfocitos B nativos y es altamente automatizado. El número de clones en un único cribado está limitado, y es necesario depender de animales inmunizados de alta calidad, y los anticuerpos sin inmunidad y antígenos de alta toxicidad no pueden prepararse. |
 | Felicia Felicia es una especialista en soporte técnico de EnkiLife, con extensa experiencia profesional en desarrollo de anticuerpos, optimización y diseño y aplicación de ensayos ELISA. Se dedica a asistir a nuestros clientes en la selección de productos de anticuerpo adecuados, optimizar los protocolos experimentales de ELISA y resolver desafíos técnicos encontrados durante el proceso, apoyando así el progreso fluido de sus proyectos de investigación en ciencias de la vida. |