Características del Colorante Fluorescente o Marcador

Fluor350 es un tinte fluorescente azul excelente, un tinte modificado basado en el esqueleto del tinte de coumarina 7-AMCA. Puede servir como una excelente alternativa a AMCA, utilizado comúnmente en imagenología fluorescente y análisis de citometría en flujo, con buena solubilidad en agua e insensibilidad al pH. Los espectros de excitación y emisión de Fluor350 son cercanos a los de DAPI, y puede ser directamente visualizado utilizando conjuntos de filtros DAPI.

Figura 1: Esquema del esquema químico de Fluor350SE, mostrando su composición molecular y método de enlace

Figura 2: Espectros de excitación y emisión de Fluor350, mostrando sus características de excitación en 346nm y emisión en 445nm

Figura 3: Comparación de espectros de Fluor350 y tinte aproximado (AMCA, DAPI)

Figura 4: Comparación de la intensidad fluorescente relativa entre Fluor350 y AMCA, mostrando el excelente rendimiento de Fluor350 después de la tinción proteica

El máximo de excitación/emisión del tinte fluorescente azul Fluor405 es 400/424nm, que coincide casi perfectamente con las líneas espectrales del láser violeta de 405nm ampliamente utilizado en microscopía fluorescente y citometría en flujo. Los espectros de excitación y emisión de Fluor405 superponen altamente a los del tinte BV421. Fluor405 es un derivado del tinte Cascade Blue, pero con propiedades fluorescente optimizadas después de la modificación estructural. La superposición espectral entre el tinte Fluor405 y fluoróforos verdes es mínima, lo que lo convierte en una elección ideal para aplicaciones multicolor.

Figura 1: Esquema del esquema químico de Fluor405SE, mostrando su composición molecular y método de enlace

Figura 2: Espectros de excitación y emisión de Fluor405

Figura 3: Comparación de Fluor405 y espectros de tinte aproximado (DyLight 405, BV421)

Entre los tintes activos que absorben luz en el rango de longitudes de onda de 400-450nm, usualmente no se produce fluorescencia significativa por encima de 500nm. El tinte Fluor430 llena este vacío en el rango de longitudes de onda. Cuando se excita cerca de su pico de absorción a 430nm, este tinte exhibe un gran desplazamiento Stokes y una intensa fluorescencia amarillo-verde.

Figura 1: Esquema del esquema químico de Fluor430SE, mostrando su composición molecular y método de enlace

Figura 2: Espectros de excitación y emisión de Fluor430

Fluor488 es rodamina verde sulfonada. Al introducir dos iones sulfonato, Fluor488 ha mejorado significativamente la solubilidad en agua, estabilidad al pH y fotostabilidad. A diferencia de los tintes de fluoresceína, la fluorescencia de Fluor488 permanece invariable a través de un amplio rango de pH (4-10). Debido a sus múltiples cargas negativas, Fluor488 es menos propenso a la agregación intermolecular, y cuando múltiples moléculas de tinte etiquetan la misma proteína, es menos propenso a la auto-extinción fluorescente o a causar agregación proteica. Fluor488 es un excelente sustituto para la fluoresceína (FITC o FAM) y CY2, desempeñándose extremadamente bien en detección de moléculas bioconjugadas individuales, espectroscopía de correlación fluorescente y mediciones de polarización fluorescente. También se utiliza ampliamente en microscopía fluorescente y citometría en flujo. Fluor488 es actualmente uno de los mejores tintes fluorescentes verdes de moléculas pequeñas solubles en agua.

Figura 1: Esquema del esquema químico de Fluor488SE, mostrando su composición molecular y método de enlace

Figura 2: Espectros de excitación y emisión de Fluor488

Figura 3: Comparación de Fluor488 y espectros de tinte aproximado (Cy2, FITC)

Figura 4: Comparación de intensidad fluorescente relativa entre anticuerpos conjugados con IgG anti-muñón preparados con tinte Fluor 488 y fluoresceína isotiocianato (FITC). Usando la misma cantidad de anticuerpo, los resultados muestran que los anticuerpos etiquetados con Fluor 488 tienen mayor brillo fluorescente.

Figura 5: Comparación de brillo entre anticuerpos anti-muñón IgG de conejo etiquetados con Fluor488 y anticuerpos anti-muñón IgG de conejo etiquetados con Cy2. Las muestras de células sanguíneas humanas fueron bloqueadas primero con suero normal de conejo, luego incubadas con anticuerpos monoclonales anti-CD3 de ratón, las células se lavaron, re-suspendieron y luego incubadas con la misma concentración de anticuerpos secundarios anti-muñón IgG etiquetados con Fluor 488 o Cy2 respectivamente. Después de lisado de glóbulos rojos, la detección por citometría en flujo mostró que los anticuerpos secundarios etiquetados con Fluor488 fueron más efectivos.

Figura 6: Usando Fluor488 y FITC para etiquetar directamente anticuerpos monoclonales anti-Muñón CD4, usando la misma cantidad de anticuerpo, citometría en flujo detectó intensidad de señal, los anticuerpos anti-Muñón CD4 etiquetados con Fluor488 tuvieron mayor intensidad de señal fluorescente.

Fluor555 es un tinte fluorescente naranja-rojizo, un análogo de Cyanine3, utilizado comúnmente para reemplazar tintes Cyanine3 y TAMRA. El tinte Fluor555 tiene alta polaridad, solubilidad fuerte en agua, excelente brillo fluorescente y estabilidad fluorescente, lo que lo convierte en un buen tinte para etiquetado proteico/anticuerpo. Desde una perspectiva de estructura química, el núcleo padre de Fluor555 es la cianina Cyanine3, pero el núcleo padre tiene hasta 4 grupos ácido sulfónico. La estructura tetrasulfónica lo hace extremadamente hidrofílico, y cuando el tinte se etiqueta en la superficie proteica, no cambia la polaridad de la superficie proteica, reduciendo el riesgo de agregación proteica hidrófoba y precipitación, y reduciendo enormemente la probabilidad de extinción fluorescente debido a la proximidad local del tinte. Por lo tanto, las proteínas etiquetadas con Fluor555 suelen emitir una fluorescencia más fuerte. Sin embargo, porque la mayoría de los citómetros en flujo actuales en el mercado son citómetros en flujo tradicionales (no citómetros espectrales), la compatibilidad láser no es óptima, por lo que el tinte Fluor555 se usa más en el campo de imagenología fluorescente.

Figura 2: Espectros de excitación y emisión de Fluor555

Figura 3: Comparación de Fluor555 y tintes aproximados (Cy3, TRITC)

Figura 4: Iluminando continuamente concentraciones equimolares de Fluor 555 libre y Cy3, se recolectaron puntos de datos cada cinco segundos. La intensidad fluorescente ha sido normalizada a la misma intensidad inicial. Los resultados muestran que Fluor 555 tiene una resistencia más excelente al fotoblanqueamiento.

Figura 5: Comparación de intensidad fluorescente relativa entre anticuerpos conjugados con IgG anti-conejo etiquetados con dos tintes (Fluor555 y Cy3) en diferentes ratios de tinte-proteína. Muestra que Fluor555 tiene mayor intensidad fluorescente relativa, y la señal no decae cuando el grado de etiquetado (DOL) es tan alto como 8 o superior.

El tinte fluorescente Fluor568 coincide perfectamente con láseres de 561nm. El máximo de excitación/emisión de este tinte rojizo-naranja es aproximadamente 578/602nm, lo que puede lograr un efecto de excitación óptimo en el diodo láser de 561nm utilizado en muchos microscopios de barrido láser confocal. Fluor568 tiene un núcleo padre de compuestos rodamina, y se introducen dos iones sulfonato para optimizar la solubilidad en agua y propiedades ópticas del tinte. Cuando se excita, emite una fluorescencia naranja-rojiza brillante, que es muy sensible y estable, y puede utilizarse para detectar objetivos de baja abundancia. Es un excelente tinte fluorescente soluble en agua de molécula pequeña.

Figura 2: Espectros de excitación y emisión de Fluor568

Figura 3: Comparación de Fluor568 y espectros de tinte aproximado (Rhodamine Red)

Fluor594 es un compuesto de rodamina metilado sobre la base de la estructura Fluor568. Dos iones sulfonato también juegan un papel en optimizar las propiedades del tinte. Cuando se excita, emite una fluorescencia roja brillante, que es muy sensible y estable, y puede utilizarse para detectar objetivos de baja abundancia. Fluor594 es un excelente tinte fluorescente soluble en agua de molécula pequeña, adecuado para etiquetar diversas moléculas objetivo, y utilizado ampliamente en diversos experimentos biológicos. Los conjugados preparados con el tinte Fluor594 emiten fluorescencia en la región roja del espectro, por lo que son particularmente adecuados para experimentos de etiquetado multiplex combinados con sondas fluorescentes verdes. Las características espectrales de Fluor594 son similares a las de Cyanine3.5 y Texas Red, pero la intensidad de fluorescencia es más fuerte, convirtiéndolo en un excelente sustituto para Texas Red.

Figura 1: Esquema del esquema químico de Fluor594SE, mostrando su composición molecular y método de enlace

Figura 2: Espectros de excitación y emisión de Fluor594

Figura 3: Comparación de Fluor594 y espectros de tinte aproximado (DyLight 594, Texas Red)

Figura 4: Comparación de intensidad fluorescente relativa entre anticuerpos anti-muñón IgG etiquetados con Fluor 594 y Texas Red-X a diferentes ratios de tinte-proteína. Muestra que Fluor 594 tiene una intensidad fluorescente más fuerte.

El espectro del tinte fluorescente Fluor647 coincide casi completamente con el de Cyanine5, por lo que la compatibilidad con filtros ópticos diseñados para Cyanine5 también puede ser óptima. Sin embargo, la intensidad fluorescente total de los conjugados de anticuerpos Fluor647 suele ser significativamente mayor que la de los conjugados de Cyanine5. Además, cuando Fluor647 se conjugan con la mayoría de las proteínas, oligonucleótidos y ácidos nucleicos, su absorbancia o espectro fluorescente muestra casi ningún cambio, por lo que bajo el mismo grado de sustitución, la intensidad fluorescente total es mayor, convirtiéndolo en un excelente sustituto para Cyanine5.

Figura 1: Espectros de excitación y emisión de Fluor647

Figura 2: Comparación de Fluor647 y espectros de tinte aproximado (APC, Cy5)

Figura 3: Comparación del brillo de conjugados de anticuerpos fluorescentes con Fluor647 y Cy5. Muestra que el brillo de los conjugados de Fluor 647 es mucho mayor que el de los conjugados usando Cy5.

La longitud de onda de excitación pico del tinte Fluor680 es 680nm, y la longitud de onda de emisión máxima es 702nm. Sus características espectrales son similares al tinte Cyanine5.5. La fluorescencia del tinte Fluor680 está claramente separada de las señales de emisión de otros tintes rojos comúnmente utilizados (como tetrametilrodamina, R-ficoeritrina, Fluor594 y Fluor647), por lo que es muy adecuado para etiquetado multicolor.

Figura 1: Espectros de excitación y emisión de Fluor680

Figura 2: Comparación de espectros fluorescentes entre Fluor680 y Cy5.5. Muestra que sus espectros son básicamente consistentes.

Fluor750 es espectralmente muy similar al tinte Cyanine7, y es un excelente sustituto para Cyanine7. La longitud de onda máxima de emisión fluorescente es 770nm, que está lejos de la longitud de onda de emisión máxima de sustancias fluorescentes rojas comúnmente utilizadas (Fluor647 o APC), lo que facilita el análisis multicolor.

Figura 1: Espectros de excitación y emisión de Fluor750

Figura 2: Comparación de Fluor750 y espectros de tinte aproximado (Cy7)