Los tipos de ELISA
ELISA se puede utilizar para determinar antígenos y también anticuerpos. Hay tres reactivos necesarios en este ensayo: (1) Antígenos o anticuerpos adsorbidos por portadores de fase sólida. (2) Antígenos o anticuerpos etiquetados con enzimas. (3) Sustratos para reacciones enzimáticas. Dependiendo de la fuente del reactivo y de la muestra, así como de las condiciones específicas de la prueba, se pueden diseñar varios tipos de métodos de ensayo.
Existen diferentes opiniones sobre la detección y clasificación de ELISA, y distintas literaturas tienen diferentes clasificaciones en cuanto al principio o operación. Aquí dividimos el ELISA en las siguientes cuatro categorías y luego explicamos cada categoría en detalle: (1) ELISA directo; (2) ELISA indirecto; (3) ELISA sándwich; (4) ELISA de inhibición competitiva. Todos los demás métodos de ELISA pertenecen a estos cuatro tipos de ELISA o se derivan de combinaciones de estos cuatro tipos de ELISA.
1. ELISA Directo
El ELISA directo es el tipo de ELISA más simple en términos de procedimiento. Su método implica recubrir directamente un antígeno o anticuerpo sobre un portador de fase sólida, seguido del enlace específico con un anticuerpo o antígeno etiquetado con enzima, y luego utilizar la enzima para catalizar el desarrollo del color del sustrato. La profundidad del color desarrollado es proporcional a la cantidad de anticuerpo o antígeno etiquetado con enzima añadido. Aunque el ELISA directo es muy sencillo de operar y tiene pasos relativamente concisos, su rango de aplicación sigue siendo bastante limitado. Una razón importante es que solo un paso de amplificación de señal está involucrado en este tipo de ELISA, por lo que su sensibilidad no es muy alta. Además, las sustancias que puede detectar son también muy limitadas, ya que solo puede medir moléculas etiquetadas con enzima.
2. ELISA Indirecto
El ELISA indirecto se usa comúnmente para la detección de anticuerpos. Sus pasos procedimentales iniciales son en gran parte consistentes con los del ELISA directo, con la diferencia clave de que en el ELISA indirecto, la molécula que se une al antígeno pre-recubierto es un anticuerpo no etiquetado en lugar de uno etiquetado con enzima. Posteriormente, se añade un segundo anticuerpo; este anticuerpo secundario está etiquetado con enzima y puede unirse específicamente al anticuerpo primario. Finalmente, se introduce un sustrato para inducir el desarrollo del color, e interpretan los resultados. Cuando la concentración del anticuerpo secundario es fija, la intensidad final del desarrollo de color tiene una correlación positiva con la cantidad del anticuerpo primario.
Dado que los anticuerpos secundarios son generalmente anticuerpos policlonales, múltiples moléculas de anticuerpo secundario pueden unirse a una sola molécula de anticuerpo primario. Al mismo tiempo, múltiples moléculas enzimáticas pueden conjugarse con una sola molécula de anticuerpo secundario, lo que mejora significativamente la sensibilidad de detección. Además, los anticuerpos secundarios son relativamente fáciles de preparar y han estado disponibles comercialmente durante mucho tiempo. Esto elimina la necesidad de que los operadores etiqueten los anticuerpos primarios con enzimas, reduciendo enormemente la carga de trabajo.
El ELISA indirecto juega un papel crucial en la determinación del título de anticuerpos, el título de suero y la selección de anticuerpos monoclonales. En el diagnóstico clínico, también sirve como un método importante para detectar anticuerpos marcadores.
3. ELISA Sándwich
En general, el ELISA sándwich puede dividirse en dos tipos: ELISA sándwich directo y ELISA sándwich indirecto.
ELISA Sándwich Directo puede dividirse aún más en dos subtipos: ELISA sándwich doble anticuerpo y ELISA sándwich doble antígeno.
ELISA Sándwich Doble Anticuerpo El primer anticuerpo (anticuerpo de captura) se recubre sobre un portador de fase sólida. Luego, se añade el antígeno a detectar. Después de la incubación, se introduce el segundo anticuerpo (anticuerpo de detección). El anticuerpo de captura y el anticuerpo de detección pueden ser dos anticuerpos monoclonales que apuntan a epítopos diferentes, o un anticuerpo monoclonal y un anticuerpo policlonal que apuntan al mismo antígeno. Sin embargo, el anticuerpo de detección debe estar etiquetado con enzima. Para el ELISA sándwich doble anticuerpo, el analito objetivo (antígeno a detectar) debe contener dos o más epítopos; de lo contrario, el anticuerpo de detección no puede unirse al antígeno. Por ejemplo, haptenes y antígenos de moléculas pequeñas no pueden detectarse usando ELISA sándwich doble anticuerpo.
ELISA Sándwich Doble Antígeno La operación es básicamente la misma que la del ensayo sándwich doble anticuerpo. La diferencia es que la sustancia recubierta es un antígeno, el objeto a detectar es un anticuerpo, seguido de la adición de un antígeno etiquetado con enzima, y luego un sustrato para inducir el desarrollo del color. El procedimiento operativo básico del ELISA sándwich doble antígeno es aproximadamente consistente con el del ELISA indirecto, pero la diferencia clave radica en que utiliza un antígeno específico en lugar del anticuerpo secundario etiquetado con enzima utilizado en el ELISA indirecto. Este diseño logra una selección a través del enlace específico de dos antígenos al anticuerpo objetivo, reduciendo efectivamente factores interferentes como los anticuerpos no específicos y las reacciones cruzadas, por lo que su especificidad de detección es mejor que la del ELISA indirecto. Sin embargo, este método también tiene limitaciones técnicas de costos obvias: requiere la preparación simultánea de dos reactivos clave, el antígeno recubierto y el antígeno etiquetado con enzima, y hay requisitos estrictos sobre la pureza y estabilidad de la actividad de estos dos antígenos, lo que resulta en que los costos generales de I+D y producción sean significativamente más altos que los del ELISA indirecto.
ELISA Sándwich Indirecto Su principio es el siguiente: un anticuerpo específico de especie se recubre sobre un portador de fase sólida para servir como anticuerpo de captura. Después de un paso de bloqueo, se añade el antígeno a detectar y se incuba. Tras lavar, se añade otro anticuerpo específico de especie para actuar como anticuerpo de detección. Finalmente, se introduce un anticuerpo secundario etiquetado con enzima, y luego se añade un sustrato para inducir el desarrollo del color.
En comparación con el ELISA sándwich doble anticuerpo directo, el ELISA sándwich indirecto incorpora un anticuerpo secundario etiquetado con enzima que reconoce específicamente al anticuerpo de detección. Esto es equivalente a añadir un paso adicional de amplificación de señal al sistema completo, haciendo que los resultados finales sean más sensibles que los del ELISA sándwich doble anticuerpo directo. Al mismo tiempo, dado que el anticuerpo secundario etiquetado con enzima en el ELISA sándwich indirecto solo puede reconocer al anticuerpo de detección y no al anticuerpo de captura, la especificidad del sistema también está garantizada. Por lo tanto, la mayoría de los kits de ELISA de nuestra empresa adoptan este método, totalizando más de dos mil. Si tiene alguna necesidad, por favor contáctenos. Visite nuestro sitio web para ver kits de ELISA.
4. ELISA de Inhibición Competitiva
El ELISA de Inhibición Competitiva, también conocido como ELISA Bloqueo, su principio principal es utilizar el antígeno o anticuerpo a detectar para interferir con un sistema pre-diseñado. El resultado final del desarrollo de color tiene una correlación negativa con el grado de interferencia causado por el antígeno o anticuerpo a detectar. El ELISA de Inhibición Competitiva tiene alta flexibilidad, y se pueden diseñar protocolos experimentales más complejos basados en él, derivando así varios métodos especiales de ELISA como ELISA de Inhibición Competitiva Directo, ELISA de Inhibición Competitiva Indirecto y ELISA Sándwich Competitivo. Aquí, solo el ELISA de Inhibición Competitiva Directo y el ELISA de Inhibición Competitiva Indirecto se toman como ejemplos para explicar brevemente el principio.
ELISA de Inhibición Competitiva Directo El antígeno se recubre previamente sobre un portador de fase sólida, y se añaden anticuerpos específicos etiquetados con enzima. Durante el experimento, se introduce el antígeno o anticuerpo a detectar. Si el objetivo a detectar es un antígeno, competirá con el antígeno pre-recubierto sobre el portador de fase sólida por los anticuerpos etiquetados con enzima añadidos. Si el objetivo a detectar es un anticuerpo, competirá con los anticuerpos etiquetados con enzima añadidos para unirse al antígeno recubierto sobre el portador de fase sólida. En ambos casos, los anticuerpos etiquetados con enzima que son descompitados se lavan durante el paso de lavado, después de lo cual se añade un sustrato para inducir el desarrollo del color. El resultado del desarrollo de color es inversamente proporcional a la cantidad del antígeno o anticuerpo a detectar. El ELISA de inhibición competitivo directo involucra dos pasos de amplificación de señal, por lo que tiene una sensibilidad relativamente alta. Después de recubrir previamente el portador de fase sólida y añadir los anticuerpos etiquetados con enzima, el experimento solo requiere diluir el antígeno o anticuerpo a detectar y añadirlo al sistema para reaccionar, lo que simplifica enormemente el proceso operativo del ELISA.
ELISA de Inhibición Competitiva Indirecto El antígeno se recubre previamente sobre un portador de fase sólida, y se añaden secuencialmente un anticuerpo específico y el correspondiente anticuerpo secundario etiquetado con enzima contra este anticuerpo para formar un sistema preliminar. Durante el experimento, se añade el antígeno diluido a detectar, y el antígeno en la muestra a probar competirá con el antígeno unido al portador de fase sólida en el sistema preliminar para unirse al anticuerpo específico. Similarmente, la muestra a probar también puede ser un anticuerpo. El ELISA de inhibición competitivo indirecto tiene una sensibilidad de detección más alta, lo cual se beneficia del efecto de amplificación de señal mediado por el anticuerpo secundario etiquetado con enzima. Este método no requiere etiquetar el anticuerpo primario; en cambio, puede utilizar anticuerpos secundarios etiquetados con enzima comerciales que se adapten a varios anticuerpos primarios diferentes, lo que resulta en una versatilidad más fuerte. Al mismo tiempo, reduce efectivamente los costos y la dificultad técnica del proceso de etiquetado de antígenos. Este método se utiliza en el kit de pruebas de seguridad alimentaria recién lanzado. Si tiene alguna necesidad, puede contactarnos. Visite nuestro sitio web para ver kits de ELISA.
Además de los varios tipos básicos de ELISA introducidos anteriormente, otros tipos de ELISA también pueden diseñarse flexiblemente según las necesidades reales. Por ejemplo, se puede introducir biotina-avidina para aumentar el factor de amplificación del sistema; otro ejemplo es que se pueden introducir anticuerpos secundarios no etiquetados, Proteína A, Proteína G, etc., para aumentar la capacidad de carga del portador de fase sólida o mejorar la especificidad del sistema.
 | Felicia Felicia es una especialista en soporte técnico en EnkiLife, con amplia experiencia profesional en desarrollo de anticuerpos, optimización y diseño y aplicación de ensayos ELISA. Se compromete a asistir a nuestros clientes en la selección de productos de anticuerpos adecuados, optimizar protocolos experimentales ELISA y resolver desafíos técnicos encontrados durante el proceso, apoyando así el progreso fluido de sus proyectos de investigación en ciencias de la vida. |