Protocol de Western Blotting: Electfoforesis en gel para proteínas
El Western Blotting (también llamado inmunoblotting) es una técnica utilizada para el análisis de proteínas individuales en una mezcla de proteínas (por ejemplo, un lisado celular). En el Western blotting (inmunoblotting), la mezcla de proteínas se aplica a una electroforesis en gel dentro de una matriz portadora (SDS-PAGE, PAGE nativa, enfoque isoeléctrico, electroforesis 2D, etc.) para separar las proteínas según tamaño, carga u otras diferencias entre las bandas individuales de proteínas. Las bandas de proteínas separadas se transfieren luego a una membrana portadora (por ejemplo, nitrocelulosa, nylon o PVDF). Este proceso se llama blotting. Las proteínas se adhieren a la membrana en el mismo patrón en que fueron separadas debido a las interacciones de cargas. Las proteínas en este inmunoblot están entonces accesibles para unión de anticuerpos con fines de detección.
Palabras clave: Investigación bio-médica, proteína, western blot
Introducción
El Western blot se utiliza a menudo en investigación para separar e identificar proteínas. En esta técnica, una mezcla de proteínas se separa basándose en el peso molecular y, por tanto, según su tipo, mediante electroforesis en gel. Estos resultados se transfieren luego a una membrana produciendo una banda para cada proteína. La membrana se incuba luego con anticuerpos marcadores específicos para la proteína de interés.
El anticuerpo unido se lava eliminando dejando solo el anticuerpo unido a la proteína de interés. Los anticuerpos unidos luego son detectados mediante desarrollo del film. Dado que los anticuerpos solo se unen a la proteína de interés, solo debería verse una banda. El grosor de la banda corresponde a la cantidad de proteína presente; por tanto, hacer un estándar puede indicar la cantidad de proteína presente. Este documento describirá primero el protocolo para Western blot, acompañado de imágenes para ayudar al lector y teoría para racionalizar el protocolo. Esto será seguido por la explicación teórica del procedimiento, y en la sección posterior, consejos para solucionar problemas comunes.
Técnica
Lisis celular para extraer proteína
Las proteínas pueden ser extraídas de diferentes tipos de muestras, como tejido o células. A continuación se presenta el protocolo para extraer proteínas de células adherentes.
Células adherentes:
Lavar las células en la campana de cultivo tisular o plato añadiendo solución salina fosfata tamponada fría (PBS) y balanceando suavemente. Descartar PBS. (Consejo: Mantener el plato de cultivo tisular sobre hielo durante todo el proceso).
Añadir PBS y utilizar un raspador celular para desprender las células. Pipetear la mezcla en tubos de microcentrifugación.
Centrifugar a 1500 RPM durante 5 minutos y descartar el sobrenadante.
Añadir 180 μL de tampón de lisis celular a temperatura del hielo con 20 μL de cóctil inhibitor de proteasas fresco. (Consejo: Si la concentración de proteína no es lo suficientemente alta al final, se recomienda repetir el procedimiento con una proporción mayor del cóctil inhibitor de proteasas).
Incubar durante 30 minutos sobre hielo, y luego aclarar el lisado centrifugando durante 10 minutos a 12.000 RPM, a 4°C.
Transferir el sobrenadante (o mezcla de proteínas) a un tubo fresco y almacenar sobre hielo o congelado a -20°C o -80°C.
Medir la concentración de proteína utilizando un espectrofotómetro.
Preparación de muestras
Determinar el volumen del extracto de proteína para asegurar 50 μg en cada pocillo.
Añadir 5 μL de tampón de muestra a la muestra, y igualar el volumen en cada carril utilizando agua H2 destilada doble (dd H2O). Mezclar bien. (Consejo: Se sugiere un volumen total de 15 μL por carril).
Calentar las muestras con placa seca durante 5 minutos a 100°C.
Preparación de gel
Después de preparar la solución de gel apilado del 10%, ensamblar el soporte para solidificación del gel [Figura 1]. (Consejo: El AP del 10% y TEMED solidifican la solución; por tanto, ambos geles pueden ser preparados al mismo tiempo si los reagentes mencionados anteriormente no se añaden hasta el final).
Añadir la solución de gel apilado cuidadosamente hasta que el nivel sea igual a la barra verde sosteniendo las placas de vidrio [Figura 2]. Añadir H2O al top. Esperar 15–30 minutos hasta que el gel se solidifica. (Consejo: Utilizar una pipeta de succión puede hacer más fácil el proceso de añadir el gel a la placa de vidrio).
Superponer el gel apilado con el gel separador, después de eliminar el agua. (Consejo: Es mejor inclinar el aparato y utilizar un pañuelo para eliminar el agua).
Insertar el peine, asegurando que no haya burbujas de aire.
Esperar hasta que el gel se solidifica. (Consejo: La solidificación puede ser fácilmente comprobada dejando alguna solución de gel en un tubo).
Figura 1.
Electroforesis
Verter el tampón de corrida en el electroforador [Figura 3].
Colocar el gel dentro del electroforador y conectar a una fuente de alimentación. (Consejo: Al conectar a la fuente siempre conectar rojo con rojo, y negro con negro).
Asegurar que el tampón cubra completamente el gel, y retirar el peine cuidadosamente.
Cargar marcador (6 μL) seguido de muestras (15 μL) dentro de cada pocillo [Figura 4].
Correr el gel con voltaje bajo (60 V) para gel separador; utilizar voltaje más alto (140 V) para gel apilado [Figura 5a y b].
Correr el gel durante aproximadamente una hora, o hasta que la frente del tinte salga por debajo del gel [Figura 6].
Electrotransferencia
Cortar 6 hojas de filtro para encajar la medición del gel, y una membrana de polivinilidene fluoride (PDVF) con las mismas dimensiones.
Humedecer la esponja y papel filtro en tampón de transferencia, y humedecer la membrana PDVF en metanol.
Separar las placas de vidrio y recuperar el gel.
Crear un sándwich de transferencia como sigue:
Esponja
3 Papeles Filtro
Gel PVDF
3 Papeles Filtro
(Consejo: Asegurar que no haya burbujas de aire entre el gel y la membrana PVDF, y exprimir líquido extra).
Reubicar el sándwich en el aparato de transferencia, que debe ser colocado sobre hielo para mantener 4°C. Añadir tampón de transferencia al aparato, y asegurar que el sándwich esté cubierto con el tampón. Colocar electrodos encima del sándwich, asegurando que la membrana PVDF esté entre el gel y un electrodo positivo [Figura 7].
Transferir durante 90 minutos [Figura 8]. (Consejo: El tiempo de corrida debe ser proporcional al grosor del gel, por lo que esto puede reducirse a 45 minutos para geles de 0.75 mm).
Bloqueo e incubación de anticuerpos
Bloquear la membrana con leche descremada al 5% en TBST* durante 1 hora.
Añadir anticuerpo primario en albúmina sérica bovina al 5% (BSA) e incubar durante la noche a 4°C sobre un agitador [Figura 9].
Lavar la membrana con TBST durante 5 minutos. Hacer esto 3 veces. (Consejo: Todos los pasos de lavado e incubación de anticuerpos deben hacerse sobre un agitador a temperatura ambiente para asegurar una agitación uniforme).
Añadir anticuerpo secundario en leche descremada al 5% en TBST, e incubar durante 1 hora.
Lavar la membrana con TBST durante 5 minutos. Hacer esto 3 veces
Preparar mezcla ECL (siguiendo la proporción de solución A y B proporcionada por el fabricante). Incubar la membrana durante 1–2 minutos [Figura 10]. (Consejo: Utilizar una pipeta de 1000 μL para asegurar que el ECL cubra el top y fondo de la membrana).
Visualizar el resultado en habitación oscura [Figura 11]. (Consejo: Si el fondo es demasiado fuerte, reducir tiempo de exposición).
Receta
Disolver lo siguiente en 800 ml de agua H2 destilada
8.8 g de NaCl
0.2g de KCl
3g de Tris base
Añadir 500ul de Tween-20
Ajustar el pH a 7.4
Añadir agua H2 destilada hasta llegar a 1L
Esterilizar por filtración o autoclavado
Teoría
Preparación de muestras
Los lisados celulares son la forma más común de muestra utilizada para Western blot. El intento de extracción de proteínas busca recolectar todas las proteínas en el citosol celular. Esto debe hacerse a una temperatura fría con inhibidores de proteasas para prevenir desnaturalización de las proteínas. Dado que muestras tisulares muestran un mayor grado de estructura, invención mecánica, tal como homogeneización o sonicación es necesaria para extraer las proteínas.
Después de extraer la proteína, es muy importante tener una buena idea de la concentración del extracto. Esto eventualmente permite al investigador asegurar que las muestras están siendo comparadas sobre una base equivalente. La concentración de proteínas a menudo se mide utilizando un espectrofotómetro. Utilizar esta concentración permite medir la masa de la proteína que está siendo cargada en cada pocillo mediante la relación entre concentración, masa y volumen.
Después de determinar el volumen apropiado de la muestra, se diluye en un tampón de carga, que contiene glicerol para que las muestras se hundan fácilmente en los pocillos del gel. Un tinte de seguimiento (azul bromofenol) también está presente en el tampón permitiendo al investigador ver cuánto ha avanzado la separación. La muestra es calentada después de ser diluida en un tampón de carga, con el fin de desnaturalizar la estructura de orden superior, mientras se retienen puentes sulfuro. Desnaturalizar la alta estructura asegura que la carga negativa de aminoácidos no sea neutralizada, permitiendo que la proteína se mueva en un campo eléctrico (aplicado durante electrotransferencia).
También es muy importante tener controles positivo y negativo para la muestra. Para un control positivo se utiliza una fuente conocida de proteína objetivo, tal como proteína purificada o un lisado de control. Esto ayuda a confirmar la identidad de la proteína, y la actividad del anticuerpo. Un control negativo es una línea celular nula, tal como β-actina, que también se usa para confirmar que el tinción no sea inespecífico.
Electroforesis en gel
El Western blot utiliza dos tipos diferentes de gel agarosa: apilado y separador. El superior, gel apilado, es ligeramente ácido (pH 6.8) y tiene una menor concentración de acrilamida haciendo un gel poroso, que separa proteínas pobremente pero permite que formen bandas finas y claramente definidas. El gel inferior, llamado gel separador o resolvente, es básico (pH 8.8), y tiene mayor contenido poliacrílamido, haciendo los poros del gel más estrechos. Las proteínas son entonces separadas por su tamaño más bien en este gel, ya que las proteínas más pequeñas viajan más fácilmente, y por tanto rápidamente, que proteínas más grandes.
Las proteínas al cargar en el gel tienen carga negativa, ya que han sido desnaturalizadas por calentamiento, y viajarán hacia el electrodo positivo cuando se aplica un voltaje. Los geles usualmente son hechos vertiéndolos entre dos placas de vidrio o plástico, utilizando la solución descrita en la sección de protocolo. Las muestras y un marcador son cargados en los pocillos, y los pocillos vacíos son cargados con tampón de muestra. El gel luego se conecta a la fuente de alimentación y se permite que corra. El voltaje es muy importante, ya que un voltaje alto puede sobrecalentar y distorsionar las bandas.
Blotting
Después de separar la mezcla de proteínas, se transfiere a una membrana. La transferencia se hace utilizando un campo eléctrico orientado perpendicularmente a la superficie del gel, causando que las proteínas se muevan fuera del gel y hacia la membrana. La membrana se coloca entre la superficie del gel y el electrodo positivo en un sándwich. El sándwich incluye una almohadilla de fibra (esponja) en cada extremo, y papeles filtro para proteger el gel y membrana de blotting [Figura 12]. Aquí dos cosas son muy importantes: (1) el contacto cercano de gel y membrana para asegurar una imagen clara y (2) la colocación de la membrana entre el gel y el electrodo positivo. La membrana debe ser colocada como tal, para que las proteínas negativamente cargadas puedan migrar desde el gel hacia la membrana. Este tipo de transferencia se llama transferencia electrofórica, y puede hacerse en condiciones semisecas o húmedas. Condiciones húmedas usualmente son más confiables ya que es menos probable secar el gel, y son preferidas para proteínas más grandes.
La membrana, el soporte sólido, es una parte esencial de este proceso. Hay dos tipos de membranas: nitrocelulosa y PVDF. La nitrocelulosa se usa por su alta afinidad para proteína y sus capacidades de retención. Sin embargo, es quebradiza, y no permite que la membrana sea usada para reprobing. En este sentido, las membranas PVDF proporcionan mejor soporte mecánico y permiten que el blot sea reprobeado y almacenado. Sin embargo, el fondo es más alto en las membranas PVDF y por tanto, lavar cuidadosamente es muy importante.
Lavado, bloqueo e incubación de anticuerpos
El bloqueo es un paso muy importante del Western blotting, ya que previene que los anticuerpos se unan a la membrana de manera inespecífica. El bloqueo usualmente se hace con BSA al 5% o leche descremada sin grasa diluida en TBST para reducir el fondo.
La leche descremada sin grasa es a menudo preferida ya que es económica y ampliamente disponible. Sin embargo, las proteínas de leche no son compatibles con todas las etiquetas de detección, por lo que se debe tener cuidado para elegir la solución de bloqueo apropiada. Por ejemplo, soluciones de bloqueo BSA son preferidas con etiquetas de biotina y anticuerpos AP, y anticuerpos antiphosphoproteína, ya que la leche contiene caseína, que es en sí misma una fosfoproteína y biotina, interfiriendo con los resultados del ensayo. Es a menudo una buena estrategia incubar el anticuerpo primario con BSA ya que usualmente es necesario en cantidades mayores que el anticuerpo secundario. Ponerlo en solución de BSA permite que el anticuerpo sea reutilizado, si el blot no da buen resultado.
La concentración del anticuerpo depende de la instrucción del fabricante. El anticuerpo puede ser diluido en un tampón de lavado, tal como PBS o TBST. El lavado es muy importante ya que minimiza el fondo y elimina anticuerpos no unidos. Sin embargo, la membrana no debe dejar lavarse por un tiempo realmente largo, ya que también puede reducir la señal.
La membrana luego es detectada utilizando el anticuerpo marcador, usualmente con una enzima tal como peroxidasa de rábanos (HRP), que es detectada por la señal que produce correspondiendo a la posición de la proteína objetivo. Esta señal se captura en un film que usualmente es desarrollado en una habitación oscura.
Cuantificación
Es muy importante estar consciente de que los datos producidos con un Western blot son típicamente considerados cuasi-cuantitativos. Esto es porque proporciona una comparación relativa de niveles de proteínas, pero no una medida absoluta de cantidad. Hay dos razones para esto; primero, hay variaciones en cargas y tasas de transferencia entre las muestras en carriles separados que son diferentes en blots separados. Estas diferencias necesitarán ser estandarizadas antes de que se pueda hacer una comparación más precisa. Segundo, la señal generada por detección no es lineal a través del rango de concentración de muestras. Por tanto, dado que la señal producida no es lineal, no debe usarse para modelar la concentración.
Conclusión
El Western blot es una técnica que es muy útil para detección de proteínas ya que permite al usuario cuantificar la expresión de proteínas también. Este documento cubrió el protocolo, la teoría detrás de ese protocolo, y algunas técnicas para solucionar problemas. El Western blot puede verse como un equilibrio intrincado, ya que el investigador intenta obtener una señal inespecífica, pero fuerte.