I. Lisado de Muestras

Preparación del Lisado de Cultivo Celular Adherente

1. Coloque los platos de cultivo celular sobre hielo y lave las células con PBS frío.
2. Retire el PBS y añada el tampón de lisado frío (1 mL por 10⁷ células/100 mm de placa).
3. Utilice un raspador plástico pre-enfriado para raspar las células adherentes de la placa. Transfiera suavemente la suspensión celular a un tubo de centrífuga pre-enfriado. Alternativamente, digiera las células con tripsina, lave con PBS y resuspenda las células en el tampón de lisado dentro del tubo de centrifugación.
4. Mezcle continuamente a 4 °C durante 30 minutos.
5. Centrifugue a 12.000 rpm durante 5 minutos a 4 °C.
6. Retire cuidadosamente el tubo de centrífuga del centrifugador y colóquelo sobre hielo. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo pre-enfriado sobre hielo.

Preparación del Lisado de Cultivo Celular en Suspensión

1. Centrifugue las células en suspensión a 300 g durante 5 minutos, deseche el sobrenadante y resuspenda las células en 10 mL de PBS frío. Centrifugue nuevamente y deseché el PBS.
2. Resuspenda las células en el PBS residual y añada el tampón de lisado frío (1 mL por 10⁷ células/100 mm de placa). Mezcle continuamente a 4 °C durante 30 minutos.
3. Centrifugue a 12.000 rpm durante 5 minutos a 4 °C.
4. Retire cuidadosamente el tubo de centrifugación del centrifugador y colóquelo sobre hielo. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo pre-enfriado sobre hielo.

Preparación del Lisado de Tejidos

1. Excise el tejido objetivo con instrumentos limpios tan rápido como sea posible sobre hielo para prevenir la proteólisis.
2. Coloque el tejido en un mortero, vierta nitrógeno líquido para "congelar rápidamente" (flash freeze) e inmézcle inmediatamente. Añada el tampón de lisado y agite continuamente a 4 °C durante 2 horas. El volumen del tampón de lisado debe determinarse basándose en la cantidad total de tejido. El extracto proteico no debe estar excesivamente diluido para evitar la pérdida de proteínas. Minimice el volumen de muestra para el carguío al gel. La concentración mínima es 0,1 mg/mL y la óptima es 1-5 mg/mL.
3. Centrifugue a 12.000 rpm durante 20 minutos a 4 °C. Retire cuidadosamente el tubo de centrifugación del centrifugador y colóquelo sobre hielo. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo pre-enfriado sobre hielo.

II. Preparación de Muestras

1. Tome una pequeña cantidad de lisado para cuantificación de proteínas. Determine la concentración proteica de cada lisado celular.
2. Determine la cantidad de carga proteica y añada 1/4 del volumen de tampón de muestra 5X.
3. Para reducción y desnaturalización de muestras, hierva el tampón de mezcla a 100 °C durante 5 minutos.

III. Carguío y Electroforesis en Gel

1. Cargue las muestras preparadas en los pocillos del gel de SDS-PAGE. La cantidad total de proteína para lisados celulares o homogeneizados de tejidos es 20-30 μg, y para proteínas purificadas, es 10-100 ng.
2. Ejecute el gel a 100 V durante 1-2 horas. El tiempo y voltaje pueden requerir optimización. Recomendamos seguir las instrucciones del fabricante. A menos que se recomiende lo contrario por la hoja de datos del anticuerpo, utilice un gel reductor.

Porcentaje del Gel según Tamaño Proteico

También se pueden utilizar geles de gradiente.

IV. Transferencia de Proteínas desde el Gel a la Membrana

La membrana puede ser de nitrocelulosa o PVDF. Las membranas de PVDF se utilizan comúnmente y deben activarse con metanol durante 1 minuto antes del uso y enjuagarse con tampón de transferencia antes de preparar el apilamiento de transferencia. El tiempo y voltaje de transferencia necesitan optimizarse según el tampón de transferencia, y recomendamos seguir las instrucciones del fabricante. La transferencia proteica puede comprobarse con tinción de Ponceau S antes de la etapa de bloqueo.

V. Bloqueo e Incubación de Anticuerpos

1. Bloquee la membrana con tampón de bloqueo (5% leche descremada/1% BSA) durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C.
2. Retire la solución de bloqueo y diluya el anticuerpo primario con tampón de dilución de anticuerpos según las instrucciones del fabricante. Incube la membrana durante la noche a 4 °C o durante 2 horas a temperatura ambiente.
3. Lave la membrana con TBST tres veces, 5 minutos cada una.
4. Diluya el anticuerpo secundario conjugado con tampón de dilución de anticuerpos según las instrucciones del fabricante e incube la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente.
5. Lave la membrana con TBST tres veces, 5 minutos cada una.

VI. Detección (Método ECL)

1. Preparación de la Solución de Trabajo ECL: Mezcle volúmenes iguales de Solución A y Solución B.
2. Incubación: Cubra uniformemente la superficie de la membrana e incube a temperatura ambiente en oscuridad durante 1 minuto.
3. Eliminación del exceso de líquido: (no deje que la membrana se seque).
4. Exposición: Exponga a película de rayos X en una sala oscura (de 5 segundos a 10 minutos).

VII. Recetas de Tampones

Tampón de Lisado RIPA

50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% sodio desoxicolato, 0,1% SDS. Añada el cóctil de inhibidor de proteasas 1X antes del uso.

Tampón de Transferencia

25 mM Tris-base, 190 mM glicina, 20% metanol (para membranas PVDF), 10% metanol (para membranas de nitrocelulosa).

Tampón Lavado TBST

20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20.