Las siguientes consideraciones son útiles al seleccionar anticuerpos secundarios:

1. Identifique la especie huésped del anticuerpo primario, es decir, la especie contra la cual reacciona el anticuerpo secundario (por ejemplo, para el anticuerpo monoclonal anti-MS2 de conejo, la especie huésped del anticuerpo primario es el conejo).

2. Seleccione una especie huésped adecuada para el anticuerpo secundario (por ejemplo, Anti-IgG de cabra anti-ratón, donde la especie huésped del anticuerpo secundario es la cabra).

3. Considere la reactividad cruzada o la especificidad del anticuerpo secundario, y si ha sido adsorbido en croce.
4. Considere si se utilizará para aplicaciones de etiquetado multiplex o si la muestra contiene anticuerpos endógenos.
5. Especificidad: Asegúrese de que se una correctamente a la clase o fragmento del anticuerpo primario.
6. Seleccione el conjugado adecuado según el método de detección.

Los anticuerpos secundarios se elevan contra la especie del anticuerpo primario. Por lo tanto, necesita un anticuerpo secundario elevado en una especie diferente de la especie huésped de su anticuerpo primario. Por ejemplo, si su anticuerpo primario fue elevado en conejo, necesitará un anticuerpo anti-conejo secundario elevado en una especie no conejo (por ejemplo, cabra, ratón, etc.).

Algunos de nuestros valores recomendados de dilución/concentración de anticuerpos se derivan de experimentos durante el desarrollo del anticuerpo o basados en la experiencia de nuestros colaboradores y otros clientes. Debido a las diferencias en las muestras o condiciones experimentales, pueden no funcionar óptimamente en su experimento específico. Si nuestra recomendación no funciona para usted, por favor intente probar varias diluciones/concentraciones diferentes.

Goat Anti-Mouse IgG (H+L) está disponible en varios grados, y hay cierta similitud de secuencia entre los anticuerpos IgG e IgM. Por lo tanto, Goat Anti-Mouse IgG (H+L) que no ha sido adsorbido en croce puede exhibir cierto grado de reactividad cruzada con anticuerpos mouse IgM. Si se requiere una ausencia completa de reactividad cruzada con anticuerpos IgM, puede elegir anticuerpos como Goat Anti-Mouse IgG1, Goat Anti-Mouse IgG2a, Goat Anti-Mouse IgG2b, etc.

Goat Anti-Mouse IgG (H+L) se unirá a todas las subclases de mouse IgG, incluyendo IgG3.

Este anticuerpo no ha sido adsorbido en croce contra rat IgG, y no tenemos información extensa sobre esto. Sin embargo, considerando que el anticuerpo en cuestión es policlonal, esta posibilidad no puede descartarse.

El inmunógeno para Goat Anti-Mouse IgG (H+L) incluye tanto cadenas pesadas como ligeras. La cadena ligera puede ser kappa o lambda. Por lo tanto, este anticuerpo reaccionará con anticuerpos primarios que llevan cadenas kappa, pero no es específico exclusivamente para la cadena kappa.

Un anticuerpo etiquetado con dos diferentes conjugados permite tanto imágenes cromogénicas como fluorescentes en la misma muestra. Por lo tanto, los estudios multimodales son posibles, y podemos proporcionar etiquetado personalizado para este propósito.

Los anticuerpos secundarios se unen a los anticuerpos primarios. Por lo tanto, el rango de aplicación de un anticuerpo secundario está más estrechamente relacionado con el anticuerpo primario. Si un anticuerpo primario puede usarse en ciertos inmunoensayos, el anticuerpo secundario generalmente también puede usarse. En consecuencia, el alcance final de la aplicación depende principalmente del rango de aplicación del anticuerpo primario, el tipo de etiqueta del anticuerpo secundario y el sistema de salida de señal.

Todos los fluoróforos se desvanecerán o sufrirán "photobleaching" (desvanecimiento foto) en cierta medida cuando estén expuestos a luz intensa a su longitud de onda de absorción. Las soluciones posibles incluyen:

1. Elija tintes más fotostables, como los tintes Fluor.
2. Establezca flexiblemente el contratinte y el campo visual, luego cambie al tinte objetivo para la imagen.
3. Reduzca el tiempo de exposición e intensidad, por ejemplo, reduciendo la potencia del láser o utilizando filtros de densidad neutra.
4. Mantenga el tiempo de observación de las muestras etiquetadas lo más corto posible y cierre la obturadora cuando no esté viendo.
5. Utilice objetivos con apertura numérica menor, como objetivos de baja potencia.

El sistema clásico ELISA a menudo utiliza un formato de ensayo sandwich, involucrando un anticuerpo de captura y un anticuerpo de detección. Si ambos anticuerpos son anticuerpos monoclonales mouse, el HRP-etiquetado Goat Anti-Mouse IgG se uniría a ambos, haciendo que el ensayo no sea específico. Por lo tanto, en un sistema ELISA, la especie huésped del anticuerpo de captura no debe ser mouse, mientras que el anticuerpo de detección debe ser derivado de mouse. Además, el tipo de muestra detectada no debería contener mouse IgG o moléculas similares.

Utilizar anticuerpos secundarios conjugados con diferentes fluoróforos para inmunofluorescencia multicolor es viable, pero requiere un diseño cuidadoso y consideración:

1. Selección de Fluoróforo: Elija fluoróforos cuyas espectras de excitación y emisión estén lo más separadas posible. Menor superposición espectral reduce la posibilidad de crosstalk (sangrado). Prefiera combinaciones de tintes con picos de emisión ampliamente espaciados (por ejemplo, la combinación de Fluor488, Fluor555 y Fluor647 es muy clásica).
2. Compatibilidad Instrumental: Asegúrese de que el fluoróforo que seleccione pueda ser excitado efectivamente y detectado por los láseres y conjuntos de filtros del microscopio o sistema de imagen de su laboratorio. Consulte el manual de configuración del instrumento antes de seleccionar tintes.
3. Ajuste de Brillo y Nivel de Expresión: Asigne los fluoróforos más brillantes (por ejemplo, Fluor647, Cy5) a proteínas objetivo de baja abundancia. Asigne fluoróforos menos brillantes (por ejemplo, FITC, Cy2) a proteínas objetivo de alta abundancia. Esto ayuda a equilibrar las intensidades de señal en los canales, evitando que señales fuertes enmascaren señales débiles.
4. Especificidad del Anticuerpo Secundario y Adsorción en Croce: Esto es crucial para evitar reactividad cruzada no específica e impacta directamente la confiabilidad de los resultados. Debe seleccionar anticuerpos secundarios que hayan sido adsorbidos en croce. Esto significa que el anticuerpo ha sido purificado para eliminar anticuerpos que podrían reaccionar cruzadamente con inmunoglobulinas de otras especies. Por ejemplo, si está utilizando tanto anticuerpos primarios mouse como rat, su anticuerpo anti-mouse debe ser adsorbido contra proteínas suero de rata, y viceversa. Esto asegura que el anticuerpo secundario solo se una a su anticuerpo primario específico objetivo y no reaccione cruzadamente con anticuerpos primarios de otras especies.
5. Especie Huésped: Todos los anticuerpos secundarios deben derivarse de la misma especie huésped (por ejemplo, todos derivados de cabra). Esto evita que los anticuerpos secundarios reconozcan y se unan entre sí (por ejemplo, un anti-conejo accidentalmente uniéndose a un anti-mouse), lo cual causaría falsos positivos.
6. Diseño Experimental y Controles: Sin controles adecuados, los resultados de experimentos multicolor pueden ser difíciles de interpretar. Los controles single-stain son esenciales. Para cada experimento, incluya muestras teñidas solo con un par anticuerpo primario/secundario, mientras que otros canales reciben solo diluyente secundario (o sin primario). Utilice estos controles para verificar crosstalk en cada canal bajo sus condiciones reales de adquisición de imagen. Control Vacío: Omita todos los anticuerpos primarios, incube solo con la mezcla de anticuerpos secundarios, para detectar unión no específica de los segundos. Incubación Secuencial: Se recomienda incubar anticuerpos primarios de diferentes especies por separado primero, luego incubar los anticuerpos secundarios específicos de especie correspondientes como una mezcla. Esto puede reducir el riesgo de reacción cruzada en comparación con mezclar todos los primarios y luego todos los secundarios.
7. Optimización de Concentración del Anticuerpo (Titulación): Siempre titule cada par de anticuerpos antes del uso para encontrar la concentración óptima que da la mayor relación señal-ruido. Concentraciones excesivamente altas aumentan el fondo y la unión no específica.
8. Adquisición e Imagen: Incluso con un experimento bien ejecutado, una adquisición de imagen incorrecta puede arruinar los resultados. Evite excitación y adquisición simultáneas de todos los canales. Configure la secuencia de adquisición para excitar y capturar cada canal por separado (secuencialmente). Esto elimina completamente el crosstalk entre canales durante la adquisición. Desmezcla Espectral: Si su instrumento tiene esta capacidad (por ejemplo, algunos microscopios confocales), puede separar efectivamente señales fluorescentes con espectras altamente superpuestas y es una herramienta poderosa para experimentos multicolor. Procesamiento posterior: Si se detecta crosstalk menor, el software a veces puede usarse para cálculos de desmezcla espectral, pero el mejor enfoque es evitar el crosstalk durante la fase de diseño experimental.