Preguntas Frecuentes sobre la Preparación de Anticuerpos - Inmunización Animal
En la preparación de anticuerpos monoclonales y policlonales, la inmunización animal es uno de los pasos fundamentales. Su objetivo es estimular el sistema inmunitario del animal para producir anticuerpos específicos contra el antígeno diana. Los procedimientos de inmunización para ambos tipos de anticuerpos comparten ciertas similitudes, pero también exhiben diferencias debido a sus objetivos de preparación distintivos.
1. Pretratamiento del Antígeno
Los antígenos proteicos deben garantizar una pureza >90% para evitar la interferencia de proteínas impuras con la respuesta inmune. Para compuestos de bajo peso molecular o polipéptidos, se requiere conjugación con proteínas portadoras (como BSA o KLH), siendo el KLH generalmente la opción preferida.
2. Selección de Animales Experimentales
Para la preparación de anticuerpos policlonales, se utilizan comúnmente conejos blanco neozelandeses, cabras, ovejas y otros animales. Entre ellos, los conejos son los más frecuentemente elegidos debido a su tamaño corporal moderado, respuesta inmunitaria estable y facilidad para la extracción sanguínea. Para antígenos específicos, también pueden seleccionarse cobayas, gallinas y otros animales. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, los ratones BALB/c son la opción principal para la inmunización. Si el antígeno tiene baja inmunogenicidad, se pueden utilizar otras cepas como las ratas.
3. Adyuvantes y Reactivos de Inmunización
Los adyuvantes comúnmente utilizados para la inmunización son el Adyuvante Completo de Freund (FCA) y el Adyuvante Incompleto de Freund (FIA). El FCA contiene Mycobacterium tuberculosis y tiene un fuerte efecto potenciador de la inmunidad. Generalmente se utiliza para la inmunización primaria. El FIA no contiene componentes bacterianos, lo que reduce las reacciones inflamatorias en los animales y es adecuado para las posteriores inmunizaciones de refuerzo. Antes de la inmunización, el adyuvante de Freund debe estar completamente emulsionado con el antígeno previamente para formar gotas de emulsión estables y prevenir la estratificación.
4. Ambiente de Alojamiento Animal
El ambiente de alojamiento debe cumplir con los estándares de grado SPF. La temperatura debe controlarse entre 20–25°C, la humedad entre 40%–60%, y el ciclo de luz se establece en 12 horas de luz/12 horas de oscuridad. Se debe garantizar la esterilidad del pienso y el agua potable para evitar estresores externos que afecten el efecto de inmunización.
5. Determinación del Títul
Generalmente, después de 3 rondas de inmunización, se toma sangre desde la punta de la cola del ratón o de la vena marginal de oreja del conejo, y el títul de anticuerpos séricos se detecta mediante ELISA indirecto. Una vez que el títul cumple con los estándares, se administra una inmunización de refuerzo sin adyuvante 3–5 días antes de la fusión celular o la recolección de suero, generalmente a través de inyección intraperitoneal o intravenosa.
¿Por qué no hay títul de anticuerpos después de la inmunización o un títul bajo de anticuerpos tras la inmunización?
1. Independientemente de si el peso molecular y la inmunogenicidad son apropiados, el peso molecular preferiblemente no debe ser menor a 20kDa. Independientemente si los compuestos de bajo peso molecular o polipéptidos se conjugan con una proteína portadora. Para antígenos basados en proteínas, es aconsejable confirmar si la proteína está degradada mediante SDS-PAGE antes de la inmunización.
2. Si el títul de anticuerpos no cumple con los estándares después de tres rondas de inmunización, se debe aumentar el número de inmunizaciones de refuerzo. Si aún no hay mejora en el títul, es necesario re-evaluar el diseño actual del antígeno, la calidad del antígeno y el protocolo de inmunización.
3. Para la inmunización subcutánea, inyectar en tantos puntos y sitios como sea posible; si es necesario, puede combinarse con inyección intraperitoneal e inyección de vena de cola.
4. Para medir el títul inmunitario, generalmente se utiliza ELISA indirecto, lo cual requiere determinar las condiciones para la determinación de ELISA, como la concentración óptima del antígeno de recubrimiento, la concentración de anticuerpos secundarios y la sensibilidad del sustrato. Para diferentes concentraciones de antígenos, la evaluación de su potencia debe tratarse de manera diferente. Cuando la concentración de recubrimiento del antígeno es demasiado baja, puede haber un antígeno insuficiente, resultando en una señal de unión debilitada o incluso indetectable, y aunque la concentración real de anticuerpos no sea baja, podría ser juzgada erróneamente como un títul bajo.
Notas:
1. La dosis inmunológica debe establecerse razonablemente para evitar la tolerancia inmune causada por una dosis demasiado alta, y una dosis demasiado baja no puede inducir una respuesta efectiva. Las dosis regulares son suficientes.
2. Todo el proceso de preparación del antígeno, emulsificación e inyección debe realizarse en un ambiente estéril. Los operadores deben usar guantes y máscaras estériles para prevenir la contaminación microbiana del antígeno o la infección de los animales.
3. Dentro de los 30 minutos después de la inmunización, observar cuidadosamente al animal para verificar si hay enrojecimiento, hinchazón, ulceración o nódulos en el sitio de inyección. Observar cambios en la dieta del animal, bebida y peso, y si hay una disminución del apetito o pérdida de peso repentina, es necesario revisar por infección o anomalías inmunes.
4. Para reducir el impacto de las diferencias individuales entre animales, al menos 3 animales en el grupo inmunizado. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, seleccionar el animal con el títul más alto para la fusión celular. Para la preparación de anticuerpos policlonales, mezclar sueros de múltiples animales para evitar el impacto de una respuesta baja en un individuo individual sobre el efecto general.
5. Una vez que el títul de anticuerpos alcanza su punto máximo 3–5 días después de la inmunización de refuerzo, debe realizarse la recolección de sangre o la obtención del bazo prontamente para prevenir una disminución en el títul de anticuerpos debido a un retraso excesivo.
Las diferencias clave en los efectos inmunes de diferentes animales inmunizados
Animales Experimentales | Características y Ventajas | Limitaciones | Rendimiento de Anticuerpos | ||
Ratones BALB/c | Exhibe una respuesta estable a la mayoría de los antígenos, puede producir anticuerpos IgG1 altamente específicos de manera direccional y cuenta con un ciclo de inmunización corto y operación fácil, lo que lo hace adecuado para acelerar el progreso experimental. Comúnmente se utiliza en la preparación de anticuerpos monoclonales. Su eficiencia de fusión con células mieloma es extremadamente alta; los clones de hibridoma rara vez sufren pérdida cromosómica y pueden seguir secretando anticuerpos estables después del trasplante subcultivo y criopreservación, reduciendo el riesgo de pérdida de secreción de anticuerpos. | Su rendimiento de anticuerpos es bajo, obteniéndose solo 0.1–0.2 mL de suero por recolección sanguínea. No es adecuado para la preparación de anticuerpos policlonales. La concentración de anticuerpos en el sobrenadante de las células de hibridoma es baja. Su respuesta a antígenos con baja inmunogenicidad es relativamente débil, y es probable que ocurran clones no específicos. | Bajo | ||
Rata | La diversidad de células B es mayor que la de los ratones, y el umbral de tolerancia para antígenos conservados y antígenos con baja inmunogenicidad es más alto, pudiendo activar células B específicas más eficientemente, como las ratas inmunizadas con proteínas humanas conservadasy son fáciles de obtener anticuerpos bloqueantes. Son adecuados para la preparación de anticuerpos monoclonales inmunogénicos o ensayos de bloqueo funcional. La capacidad proliferativa de las células de hibridoma es fuerte, y la concentración de anticuerpos en el sobrenadante puede alcanzar 50-200 μg/mL, siendo más garantizado el rendimiento de anticuerpos cuando se expande posteriormente por cultivo. | Las células de mieloma son menos selectivas y la eficiencia de fusión es menor que la de los ratones. El ciclo de inmunización es más largo, la operación es más compleja que en los ratones y el costo de criar ratas es mayor que el de los ratones, por lo que el ciclo experimental y el costo aumentarán. El rendimiento del suero no es tan bueno como en los conejos. | Moderado | ||
Conejo | Su sistema inmunitario es relativamente complejo, la diversidad clonal de células B es mucho mayor que la de ratones y ratas, permitiendo reconocer más epítopos antigénicos. Además, su intensidad de respuesta inmune es alta, con títulos de anticuerpos séricos alcanzando 10⁶–10⁷— el más alto entre las tres especies animales. Essuitable para escenarios que requieren anticuerpos con alta especificidad y alta afinidad, y es la primera opción para la preparación de anticuerpos policlonales. | La tecnología de hibridoma de conejo es menos madura que la de ratones, hay pocas líneas de células mieloma disponibles, la eficiencia de fusión es baja y los clones de hibridoma son menos estables y propensos a perder la secreción de anticuerpos. Además, los conejos tienen un ciclo de inmunización largo, altos costos de alimentación y umbrales experimentales elevados. | Alto | ||
Cabra/Oveja | El rendimiento de anticuerpos es extremadamente alto, convirtiéndolo en el animal elegido para la preparación multiescala a gran escala. Un volumen único de recolección de sangre hasta de 50-200mL es adecuado para la producción industrial de anticuerpos. La respuesta inmune a antígenos macromoleculares es estable y los anticuerpos duran mucho tiempo. | El ciclo de inmunización es largo y la inmunización de refuerzo puede alcanzar la potencia. El costo de alimentación es alto y se requieren instalaciones profesionales de cría de animales grandes y personal para recolección sanguínea. La reactividad cruzada de anticuerpos es relativamente alta, requiriendo optimización adicional de purificación para escenarios con requisitos altos de especificidad. | Muy alto |
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