Guía de solución de problemas para ELISA
Problema: Fondo Alto
| Causa Posible | Prueba o Acción |
|---|---|
| Lavado insuficiente | Aumentar el número de lavados; Añadir un paso de remojo de 30 segundos entre los lavados |
Problema: No hay señal cuando se espera una señal
| Causa Posible | Prueba o Acción |
|---|---|
| Ingenios añadidos en orden incorrecto, o preparados incorrectamente | Repetir el ensayo; Revisar los cálculos y preparar nuevos tampones, estándares, etc. Revisar el protocolo |
| La HRP está Contaminada | Usar reactivos frescos |
| No se usó suficiente anticuerpo | Aumentar la concentración |
| El estándar está vencido (si hay señal en los pocillos de muestra) | Verificar que el estándar fue manejado según las instrucciones. Usar nuevo vial. |
| Buffer que contiene FCS usado para reconstituir anticuerpos | Recalificar tus reactivos de elección |
| El anticuerpo de captura no se unió al plato | Usar un plato ELISA (no un plato de cultivo celular) Diluir en PBS sin proteína adicional |
| Buffers contaminados | Hacer buffers frescos |
Problema: Demasiada señal - todo el plato se volvió uniformemente azul
| Causa Posible | Prueba o Acción |
|---|---|
| Lavado insuficiente/paso de lavado omitido - peroxidasa unida restante | Asegurar lavados minuciosos entre pasos. |
| Solución sustrato mezclada demasiado temprano y se volvió azul | La solución de sustrato debe ser mezclada y usada inmediatamente |
| Muchos estrepavidina-HRP | Verificar dilución, titrar si es necesario |
| Selladores de plato o reservorios de reactivos reutilizados, resultando en presencia de HRP residual. Esto volverá el TMB azul no específicamente | Usar sellador de plato fresco y reservorio de reactivo para cada paso |
| Buffers contaminados con metales o HRP | Hacer buffers frescos |
Problema: Curva estándar alcanzada pero mala discriminación entre puntos (curva baja o plana)
| Causa Posible | Prueba o Acción |
|---|---|
| No suficiente estrepavidina-HRP | Verificar dilución, titrar si es necesario |
| El anticuerpo de captura no se unió bien al plato | Usar un plato ELISA (no un plato de cultivo celular) Diluir en PBS sin proteína adicional |
| No suficiente anticuerpo de detección | Verificar dilución, titrar si es necesario |
| Plato no desarrollado lo suficientemente largo | Aumentar tiempo de incubación del sustrato Usar marca recomendada de solución sustrato |
| Procedimiento incorrecto | Volver al Protocolo General ELISA; eliminar modificaciones, si las hay |
| Cálculo incorrecto de diluciones del estándar | Revisar cálculos, hacer nueva curva estándar |
Problema: Duplicados Pobres
| Causa Posible | Prueba o Acción |
|---|---|
| Lavado insuficiente | Si se usa una lavadora de platos automática, verificar que todos los puertos estén limpios y libres de obstrucciones, añadir un paso de remojo de 30 segundos y rotar el plato a mitad del lavado |
| Cobertura desigual del plato debido a error procedural o mala calidad del plato (puede unirse desigualmente) | Diluir en PBS sin proteína adicional Verificar volúmenes, tiempos y método de adición de reactivos. Verificar el plato usado Usar un plato ELISA (no un plato de cultivo celular) |
| Sellador de plato reutilizado | Usar un sellador de plato fresco para cada paso |
| No se usaron selladores de plato | Usar selladores de plato |
| Buffers contaminados | Hacer buffers frescos |
Problema: Pobre reproducibilidad ensayo a ensayo
| Causa Posible | Prueba o Acción |
|---|---|
| Lavado insuficiente | Si se usa una lavadora de platos automática, verificar que todos los puertos estén limpios y libres de obstrucciones |
| Variaciones en temperatura de incubación | Apegarse a la temperatura de incubación recomendada Evitar incubar platos en áreas donde las condiciones ambientales varían |
| Variaciones en protocolo | Apegarse al mismo protocolo de ejecución a ejecución |
| Sellador de plato reutilizado, resultando en presencia de HRP residual que volverá el TMB azul | Usar sellador de plato fresco para cada paso |
| Cálculo incorrecto de diluciones del estándar | Revisar cálculos, hacer nueva curva estándar Usar controles internos |
| Buffers contaminados | Hacer buffers frescos |
Problema: No hay señal cuando se espera una señal, pero la curva estándar parece bien
| Causa Posible | Prueba o Acción |
|---|---|
| No hay citoquina en la muestra | Usar controles internos Repetir experimento, reconsiderar parámetros experimentales |
| Matriz de muestra está ocultando detección | Diluir muestras al menos 1:2 en diluyente apropiado, o preferiblemente, hacer una serie de diluciones para observar recuperación |
Problema: Muestras leyendo demasiado alto, pero la curva estándar parece bien
| Causa Posible | Prueba o Acción |
|---|---|
| Muestras contienen niveles de citoquina por encima del rango del ensayo | Diluir muestras y ejecutar nuevamente |
Problema: Lecturas Muy Bajas a través del Plato
| Causa Posible | Prueba o Acción |
|---|---|
| Filtros/lectores incorrectos de longitudes de onda | Verificar filtros/lector |
| Tiempo de desarrollo insuficiente | Aumentar tiempo de desarrollo |
| Platos recubiertos son viejos y han entrado en descomposición | Cobrir nuevos platos |
| El anticuerpo de captura no se unió al plato | Usar un plato ELISA (no un plato de cultivo celular) Diluir en PBS sin proteína adicional |
| Buffer que contiene FCS usado para reconstituir anticuerpos | Recalificar tus reactivos de elección |
Problema: Color verde se desarrolla al añadir solución de parada cuando se usa estrepavidina-HRP
| Causa Posible | Prueba o Acción |
|---|---|
| Ingenios no mezclados lo suficiente en pocillos | Tocar plato |
Problema: Efectos de Borde
| Causa Posible | Prueba o Acción |
|---|---|
| Temperaturas desiguales alrededor de la superficie de trabajo | Evitar incubar platos en áreas donde las condiciones ambientales varían |
| Usar selladores de plato |
Problema: Deriva
| Causa Posible | Prueba o Acción |
|---|---|
| Configuración de ensayo interrumpida | La configuración del ensayo debe ser continua - tener todos los estándares y muestras preparados apropiadamente antes del inicio del ensayo |
| Ingenios no a temperatura ambiente | Asegurar que todos los ingenios estén a temperatura ambiente antes de pipetear en los pocillos, a menos que se instruya de otra manera en las inserciones del anticuerpo |