JC-1
Principio de detección de JC-1
JC-1 (también conocido como CBIC2 (3)) es una sonda fluorescente utilizada para detectar el potencial de membrana mitocondrial (Δ Ψm). Su fórmula molecular es C25H27Cl4IN4, su peso molecular es 652.23, su número CAS es 3520-43-2 y su pureza es superior al 95%. Esta sustancia se utiliza ampliamente para la detección del potencial de membrana en células, tejidos o mitocondrias purificadas.
JC-1 refleja el estado del potencial de membrana mitocondrial a través de cambios en el color de fluorescencia: a potencial alto, se agrega en la matriz mitocondrial formando J-agregados que emiten fluorescencia roja (longitud de onda de excitación/emisión 585/590nm), y a potencial bajo, existe en forma monomérica y emite fluorescencia verde (longitud de onda de excitación/emisión 514/529nm). La relación entre la intensidad de fluorescencia roja y verde puede utilizarse como indicador de despolarización mitocondrial y se utiliza comúnmente para detectar cambios de fluorescencia causados por el declive del potencial de membrana en la etapa temprana de apoptosis celular. Esta característica lo convierte en una herramienta importante para estudiar la función mitocondrial y los mecanismos de apoptosis celular.
La disminución del potencial de membrana mitocondrial es un evento característico en la etapa temprana de apoptosis celular. La transición de JC-1 desde fluorescencia roja a fluorescencia verde permite detectar fácilmente la disminución del potencial de membrana celular, y esta misma transición puede utilizarse como indicador de detección temprana de apoptosis celular.
Protocolo de detección del potencial de membrana mitocondrial JC-1
Preparación antes del experimento
1. Materiales y reactivos
- Sonda JC-1, medio de cultivo, kit de reactivo, agua ultrapura
- Tampón de tinción JC-1, tampón PBS, etc.
2. Equipo
- Microscopio de fluorescencia (equipado con luz de excitación de 488 nm, capaz de detectar fluorescencia verde a 530 nm y roja a 590 nm), citómetro de flujo (configurado para luz de excitación de 488 nm, canal FL-1 detecta fluorescencia verde a 530 nm, canal FL-2 detecta fluorescencia roja a 590 nm), equipo de control de temperatura (incubadora a 37 ℃), pipeta
3. Preparación celular
Asegurar que las células estén en fase de crecimiento logarítmico para lograr el estado óptimo del potencial de membrana.
Pasos experimentales
1. Preparación de la solución de tinción JC-1
Según las instrucciones del kit, disolver la sonda JC-1 en DMSO y diluirla con medio libre de suero hasta la concentración deseada (generalmente 2.5-10 µg/mL).
Cada pocillo de placa de seis pocillos requiere 1 mL de solución de tinción, y la suspensión celular requiere 0.5 mL de solución de tinción por cada 500000 a 1 millón de células.
Asegurar que el JC-1 esté completamente disuelto y mezclado.
2. Tinción celular
Añadir una cantidad adecuada de solución de tinción JC-1 al medio de cultivo celular y mezclar suavemente.
Incubar la placa celular en incubadora a 37 ℃, 5% CO2 durante 15-30 minutos (ajustado según el tipo celular).
Después de la tinción, lavar las células 2-3 veces con PBS previamente enfriado para eliminar sondas no unidas.
3. Procesamiento celular
Para células adherentes, recolectar la suspensión celular después de un tratamiento suave con tripsina.
Para células en suspensión, resuspender, incubar, centrifugar y lavar según los pasos.
Finalmente, resuspender las células en tampón de tinción JC-1 y preparar para la detección.
4. Detección y Recolección de Datos
Detección por microscopía de fluorescencia: Observar células con longitud de onda de excitación de 488 nm, longitud de onda de emisión de fluorescencia roja a 590 nm y longitud de onda de emisión de fluorescencia verde a 530 nm. Las células sanas exhiben fluorescencia roja, mientras que las células dañadas exhiben fluorescencia verde.
Detección por citometría de flujo: Medir la relación de fluorescencia rojo-verde del grupo celular, calcular la relación de fluorescencia rojo/verde para evaluar cambios en el potencial de membrana mitocondrial.
Análisis de resultados
Generar un gráfico de relación de fluorescencia rojo-verde mediante análisis por software.
Cuando se detecta por citometría de flujo, FL-1+ y FL-2+ son células normales, mientras que FL-1+ y FL-2- son células apoptóticas.
Precauciones
1. Disolución y preservación de JC-1:
El JC-1 se solidifica a bajas temperaturas y necesita ser disuelto en un baño de agua a 20-25 ℃ antes del uso.
Después de completar la tinción, intentar completar la prueba dentro de los 30 minutos, y el exceso de solución de tinción debe almacenarse en un baño de hielo.
2. Condiciones operativas:
Mantener a 37 ℃ durante el proceso de teñido para evitar fluctuaciones de temperatura.
Durante el lavado, mantener el tampón de tinción JC-1 alrededor de 4 ℃ para lograr mejores resultados de lavado.
3. Repetibilidad y fiabilidad experimental:
• Evitar la influencia de factores externos (como cambios de pH y fluctuaciones de temperatura) sobre las células.
Asegurar la consistencia del pH del tampón de tinción JC-1.
4. Seguridad y ajuste de compensación:
Al usar CCCP (inhibidor de la cadena de transporte de electrones mitocondrial), se deben tomar precauciones.
Al usar un citómetro de flujo para la detección, prestar atención al ajuste de compensación y utilizar microesferas de compensación o anticuerpos con tinte FITC/PE para calibración.
Preguntas frecuentes (FAQ) sobre detección de JC-1
Claro, pero no es posible detectar directamente el tejido. El tejido debe prepararse primero como suspensión monocelular y luego probado según los pasos para células en suspensión. Además, es importante notar que el proceso de preparación de suspensiones monocelulares puede causar fácilmente daño a las células, por lo que se necesita explorar el plan de preparación para evitar falsos positivos causados por cambios en el potencial de membrana mitocondrial debido a la digestión celular; Las mitocondrias también pueden extraerse de tejidos, incubarse con JC-1 y los resultados experimentales pueden detectarse utilizando un lector de ensayo inmunoenzimático fluorescente (ELISA).
No se recomienda. El contacto entre células adherentes puede resultar en un contacto desigual entre células y tintes, lo cual puede afectar la entrada del tinte JC-1 a las células, especialmente cuando el crecimiento celular es denso. Se recomienda digerir las células antes de incubar con JC-1.
No, la muestra para el experimento de JC-1 debe ser células vivas.
No, JC-1 se utiliza para la detección de muestras de células vivas y la muerte celular ocurre después de la fijación; Además, dejarlo demasiado tiempo después de la tinción puede causar apagado de fluorescencia. Se recomienda completar la detección dentro de los 30 minutos desde el momento de la tinción.