Pasos de operación de ELISA

Proceso operativo

• Cobertura del anticuerpo: Diluya el anticuerpo recubridor a la dilución requerida utilizando tampón carbonato (CBS) o solución salina tamponada con fosfato (PBS) según las necesidades experimentales. Cubra 100 μL por pocillo, incubación a 37°C durante 2 horas o a 4°C durante toda la noche.
• Deseche el líquido en los pocillos, seque y lave la placa dos veces con PBST de 10 mM (10 mM PBS + 0.05% Tween-20), mojando cada vez durante 1-2 minutos, 350 μL por pocillo, y sequelo (también puede golpear suavemente para eliminar el líquido de los pocillos).
• Bloquee con PBST de 10 mM (10 mM PBS + 0.05% Tween-20) que contenga ya sea BSA al 1% o leche desgrasada al 5%, usando 350-400 μL por pocillo, a 37°C durante 2 horas.
• Lavar la placa: siga el paso 2.                Nota: Los kits comerciales generalmente vienen pre-recubiertos con anticuerpos capturadores en las placas ELISA, por lo que los pasos 1-4 son generalmente innecesarios. Por favor verifique antes de usar.
• Añadir muestras: Establezca pocillos cero, pocillos estándar y pocillos de muestra. Añada 100 μL de diluyente de muestra a los pocillos en blanco, y añada 100 μL de estándar o muestra a los pocillos restantes                Nota: evite las burbujas, añada la muestra al fondo del pocillo, intente no tocar el pared de la placa y complete la adición de muestras en una sola placa dentro de 10 minutos.                Cubra la placa de ensayo inmunoadsorbente ligado a enzima (ELISA) con una tapa o película, e incube a 37°C durante 60-120 minutos. Para garantizar la validez de los resultados experimentales, por favor utilice una solución estándar nueva para cada experimento.
• Deseche el líquido en los pocillos, seque y lave la placa 4 veces con PBST de 10 mM (10 mM PBS + 0.05% Tween-20), mojando cada vez durante 1-2 minutos, usando 350-400 μL por pocillo, y sequelo (también puede golpear suavemente para eliminar el líquido de los pocillos).
• Añadir anticuerpo detector: Según los requisitos experimentales, diluya el anticuerpo detector con PBST a una cierta dilución, 100 μL por pocillo, a 37°C durante 1 hora.
• Lavar la placa: como paso 6.
• Añadir anticuerpo secundario: Diluya el anticuerpo secundario con PBST de 10 mM a la dilución requerida, añada 100 μL por pocillo, incube a 37°C durante 1 hora.
• Lavar la placa: como paso 6.
• Añadir TMB: Añada 100μL de solución sustrato TMB a cada pocillo, incube a 37°C en la oscuridad durante 10-30 minutos (ajuste el tiempo según los requisitos experimentales para evitar un desarrollo excesivo del color).
• Añadir solución bloqueante: Después de que el desarrollo del color alcance el nivel esperado (como un gradiente de color apareciendo en los pocillos estándar), añada 50μL de solución bloqueante (por ejemplo, ácido cítrico 2M) a cada pocillo para terminar la reacción enzimática (en este punto el color azul cambia a amarillo).
• Lectura del ensayo inmunoadsorbente ligado a enzima (ELISA): Usando 630 nm como longitud de onda de calibración, mida la absorbancia (valor OD) de cada pocillo a 450 nm con un lector ELISA secuencialmente. Lea los valores dentro de 5 minutos después de añadir la solución bloqueante.